Cartographie génomique des interactions protéine-ADN avec ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

La cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), des remodelateurs de la chromatine et d'autres facteurs réglementaires associés à la chromatine est essentielle pour comprendre tous les processus basés sur la chromatine. Bien que les approches d'immunoprécipitation à la chromatine et de séquençage à haut débit (ChIP-seq) aient été utilisées pour obtenir de nombreuses connaissances importantes sur la biologie du génome, elles ont des limitations notables. Nous avons récemment introduit une méthode alternative, appelée clivage endogène de la chromatine et séquençage à haut débit (ChEC-seq) ¹ , pour contourner ces inconvénients.

ChIP-seq est le plus souvent réalisé avec une étape initiale de réticulation de formaldéhyde (X-ChIP-seq) pour préserver les interactions protéine-ADN. Cependant, un certain nombre d'études récentes ont indiqué que X-ChIP-seq capture des interactions protéines-ADN transitoires ou non spécifiques ^{2 , 3 , 4 , 5} <Sup>, ^{6 , 7 , 8} , donnant lieu à des sites de liaison faussement positifs. En outre, la sonication, couramment utilisée pour fragmenter la chromatine dans les expériences X-ChIP-seq, cisaille préférentiellement les régions de la chromatine ouverte, ce qui conduit à une récupération partielle des fragments de ces régions ^{9 , 10} . La sonication produit également un mélange hétérogène de longueurs de fragments, limitant finalement la résolution du site de liaison, bien que l'ajout d'une étape de digestion par une exonucléase puisse grandement améliorer la résolution ^{11 , 12} . Les méthodes ChIP indigènes telles que les régions occupées des génomes provenant de la chromatine naturellement isolée purifiée par affinité (ORGANIQUE) ¹³ n'utilisent pas de réticulation et de fragmentation de la chromatine avec la nucléase micrococcie (MNase), en atténuant les biais potentiels associés à la réticulation au formaldéhyde et à la sonication. cependant,La solubilité de nombreuses protéines liées à la chromatine dans les conditions relativement douces requises pour l'extraction de la chromatine native est médiocre, entraînant potentiellement une réduction de la dynamique et / ou des faux négatifs ¹⁴ .

Alors que diverses itérations de ChIP-seq sont le plus couramment utilisées pour la cartographie génomique des interactions protéine-ADN, plusieurs techniques de cartographie basées sur la fusion de protéines d'intérêt pour diverses enzymes modifiant l'ADN ont également été mises en œuvre. Une telle approche est l'identification par l'ADN adénine méthyltransférase (DamID) ¹⁵ , dans laquelle une protéine de liaison à la chromatine est génétiquement fusionnée à Barrage et cette fusion est exprimée dans des cellules ou des animaux, entraînant une méthylation de séquences de GATC proches des sites de liaison de la protéine. DamID est avantageux en ce qu'il ne repose pas sur l'immunoprécipitation et évite ainsi la réticulation, les anticorps ou la solubilisation de la chromatine. Il est également réalisé in vivo . toutefois, La résolution de DamID est limitée à l'échelle de kilobase et l'activité de méthylation de la protéine de fusion du barrage est constitutive. Une deuxième méthode basée sur la fusion enzymatique est Calling Card-seq ¹⁶ , qui utilise une fusion d'un facteur d'intérêt pour une transposase, en dirigeant l'intégration spécifique au site des transposons. Comme DamID, Calling Card-seq n'est pas basé sur l'immunoprécipitation et a donc des avantages similaires, avec l'avantage supplémentaire d'une résolution accrue. Toutefois, Calling Card-seq peut être limité par des biais de séquences de transposases et dépend également de la présence de sites de restriction proches des sites d'insertion de transposon.

Une troisième méthode de fusion enzymatique, développée dans le laboratoire de Laemmli, est le clivage endogène de la chromatine (ChEC) ¹⁷ . Dans ChEC, une fusion entre une protéine associée à la chromatine et la MNase est exprimée dans les cellules et, après l'addition de calcium pour activer la MNase, l'ADN est clivé proximal aux sites de liaison pour les étiquetésFacteur ( figure 1 ). En conjonction avec Southern Blot, ChEC a été utilisé pour caractériser la structure de la chromatine et la liaison des protéines à un certain nombre de loci individuels dans la levure ^{17 , 18} et a été combiné avec une analyse de microarrays à basse résolution pour sonder l'interaction des composants des pores nucléaires avec la levure Génome ¹⁹ . ChEC offre des avantages similaires à DamID et Calling Card-seq, et sa résolution est presque une paire de base unique lorsqu'elle est analysée par l'extension d'amorçage ¹⁹ . ChEC est également contrôlable: le clivage d'ADN robuste par MNase dépend de l'ajout de calcium millimolaire, ce qui garantit que la MNase est inactive aux faibles concentrations de calcium libres observées dans les cellules vivantes ²⁰ .

Auparavant, nous avons postulé que la combinaison de ChEC avec le séquençage à haut débit (ChEC-seq) fournirait des cartes haute résolution des sites de liaison TF. En effet, ChEC-seq a généré des cartes haute résolution des facteurs de régulation généraux de la levure bourgeonnaire (GRF) Abf1, Rap1 et Reb1 à travers le génome ¹ . Nous avons également appliqué avec succès ChEC-seq au complexe Mediator modulaire, un conservateur, un coactivateur de transcription global essentiel ²¹ , élargissant l'applicabilité de ChEC-seq aux complexes de taille megadalton qui ne contactent pas directement l'ADN et peuvent être difficiles à cartographier par ChIP- Méthodes basées. ChEC-seq est une méthode puissante à la fois pour la validation indépendante des résultats de ChIP-seq et la génération de nouvelles connaissances sur la régulation des processus résistant aux chromatines. Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour la mise en œuvre de cette méthode dans la levure bourgeonnante.