在细胞分化过程中光介导的可逆调节丝裂原活化蛋白激酶途径<em>爪蟾</em>胚胎发育

生长因子参与广泛的细胞功能，包括增殖，分化，迁移和凋亡，并在许多生物学事件中发挥关键作用，包括胚胎发育，衰老和精神状态调节^{1,2,3,4 ， 5} 。许多生长因子通过复杂的细胞内信号传导级联信号。这些信号事件通常以精确调节的方式可逆蛋白磷酸化操作^6,7 。因此，对蛋白激酶的信号转导结果的理解，它们负责蛋白质磷酸化，这是非常重要的。

不同的生长因子通过相当普遍的细胞内信号网络起作用，即使它们刺激dist细胞反应^8,9 。受体酪氨酸激酶的常见细胞内介质包括Ras，Raf，细胞外信号调节激酶（ERK），丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ ERK激酶（MEK），磷酸肌醇3-激酶（PI3K），Akt和磷脂酶Cγ （PLCγ） ^10,11 。积累的证据表明信号多样性和特异性取决于信号传导活动的空间和时间调节¹² 。例如，在大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）中，导致细胞增殖的表皮生长因子（EGF）刺激瞬时激活ERK通路⁹ 。另一方面，导致细胞分化的神经生长因子（NGF）的刺激以持续的方式激活ERK通路9,13。在培养的r在海马神经元中，脑源性神经营养因子（BDNF）的瞬时信号传导促进原发神经突生长，而持续的信号传导导致神经突分支增加¹⁴ 。在早期胚胎发育过程中，磷酸化的ERK活性在时间上是动态的，并且在胚胎中是广泛的⁶ 。早期非洲爪蟾胚胎发生期间最近的遗传筛选显示ERK和Akt信号级联，两种下游原生生长因子途径，显示阶段特异性激活谱⁷ 。因此，对激酶信号转导结果的理解需要能够以足够的分辨率探测激酶活性的空间和时间特征的工具。

探索发育过程中信号转导的动态特性的常规实验方法缺乏理想的空间和时间分辨率。例如，药理学方法使用小化学或生物分子刺激或抑制细胞和组织中的信号转导。这些小分子的扩散性质使得将其作用限制在特定的感兴趣区域¹⁵是有挑战性的。遗传方法（ 如转基因，Cre-Lox系统或诱变）通常导致靶基因表达或蛋白活性的不可逆活化或抑制16,17,18。 Tet-On / Tet-Off系统¹⁹提供改进的基因转录的时间控制，但是缺乏严格的空间控制，因为它依赖于四环素的扩散。化学诱导的蛋白质二聚化²⁰或光解蛋白21,22,23,24中的最新发展有很大的增强作用信号网络的时间控制。然而，由于笼式化学品的扩散性质，空间控制仍然是具有挑战性的。

利用光的功能来控制蛋白质 – 蛋白质相互作用的最近出现的光生代谢途径允许以高时空精度和可逆性调节信号通路。在控制神经元激发^25,26,27之后不久，光遗传学被扩展到控制其他细胞过程，如基因转录，翻译，细胞迁移，分化和凋亡28,29,30,31,32,33 ^{， 34} 。使用p的策略最近开发了可光活化蛋白对拟南芥隐色素2（CRY2）蛋白和密码子相互作用的碱性 – 螺旋 – 环 – 螺旋（CIBN）的N末端结构域，以控制哺乳动物细胞和非洲爪蟾胚胎中的Raf1激酶活性。 CRY2在蓝光刺激下与CIBN结合，CRY2 / CIBN蛋白复合物在黑暗中自发解离³⁴ 。蓝光激发CRY2辅因子，黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），其导致CRY2的构象变化及其随后与CIBN的结合。可以通过FAD结合口袋中的突变产生CRY2的组成型活性（W374A）和黄素缺乏型（D387A）突变体：CRY2 ^W374A突变体独立于光而与CIBN结合，而CRY2 ^D387A突变体不结合蓝色的CIBN光刺激^36,37 。光生系统描述了我该方案使用野生型CRY2和CIBN诱导活细胞中的蛋白质易位介导的Raf1活化。已知Raf1的膜募集增强其活性³⁸ 。在该系统中，串联CIBN模块锚定于质膜，CRY2-mCherry与Raf135的N末端融合。在没有蓝光的情况下，CRY2-mCherry-Raf1停留在细胞质中，Raf1不活跃。蓝光刺激诱导CRY2-CIBN结合，并将Raf1募集到质膜上，其中Raf1被激活。 Raf激活刺激Raf / MEK / ERK信号级联。 CRY2-和CIBN-融合蛋白均以双顺反子基因系统编码。该策略可以被推广以控制其他激酶，例如Akt，其激活状态也可以通过细胞中的蛋白质移位而被打开³⁹ 。这项工作提出了在哺乳动物细胞培养中实现这种光遗传策略的详细协议res和多细胞生物。