Patógenos de transmisión alimentaria proyección utilizando Magneto-fluorescente Nanosensor: Detección rápida de e. Coli O157: H7
Summary
El objetivo general del presente Protocolo es sintetizar funcional nanosensores para el portable, eficiente, y rápida detección de específicamente las bacterias patógenas a través de una combinación de relajación magnética y las modalidades de emisión de fluorescencia.
Abstract
Enterohemorrágica Escherichia coli O157: H7 se ha ligado a ambas transmitidas por el agua y enfermedades transmitidas por los alimentos y sigue siendo una amenaza a pesar de los métodos de investigación de alimentos y agua utilizada en la actualidad. Mientras que los métodos convencionales de detección bacteriana, tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) y análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) detectan específicamente a contaminantes patógenos, requieren preparación de la muestra extensos y largos períodos de espera. Además, estas prácticas exigen instrumentos de laboratorio sofisticado y configuración y deben ser ejecutadas por profesionales capacitados. Aquí, se propone un protocolo para una técnica de diagnóstico más simple que ofrece una combinación única de parámetros magnéticos y fluorescentes en una plataforma basada en nanopartículas. La propuesta nanosensores de magneto-fluorescente multiparamétrico (MFnS) pueden detectar contaminación de e. coli O157: H7 con tan poco como 1 unidad formadora de colonias presente en solución en menos de 1 h. Además, la capacidad de MFnS permanecer altamente funcional en medios complejos tales como leche y agua del lago ha sido verificada. Análisis de especificidad adicional también fueron utilizados para demostrar la capacidad de MFnS para detectar sólo las bacterias objetivo específico, incluso en presencia de especies bacterianas similares. El apareamiento de las modalidades magnéticas y fluorescentes permite la detección y cuantificación de la contaminación por patógenos en una amplia gama de las concentraciones, exhibiendo su alto rendimiento en la detección de contaminación de ambas etapa temprana y tardía. La eficacia, la asequibilidad y la portabilidad de los MFnS hacen un candidato ideal para punto de atención detección de bacterias contaminantes en una amplia gama de ajustes, de reservorios acuáticos a alimentos envasados comercialmente.
Introduction
La ocurrencia persistente de contaminación bacteriana en los alimentos comercialmente producidos y fuentes de agua ha creado la necesidad de plataformas diagnóstico cada vez más rápidas y específicas. 1 , 2 algunos de los más comunes contaminantes bacterianos responsables de contaminación de alimentos y agua son de los géneros Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Vibrio, Shigella, Bacillus y Escherichia. 3 , 4 contaminación bacteriana por estos patógenos a menudo resultados en síntomas tales como fiebre, cólera, gastroenteritis y diarrea. 4 contaminación de fuentes de agua a menudo tiene efectos drásticos y nocivos en las comunidades sin acceso a agua suficientemente filtrada y contaminación de los alimentos ha llevado a un gran número de enfermedades y los esfuerzos de recuperación de producto. 5 , 6
Con el fin de reducir la ocurrencia de enfermedades causadas por contaminación bacteriana, ha habido una serie de esfuerzos para desarrollar métodos con que agua y comida pueden eficientemente analizará antes de la venta o consumo. 3 técnicas como PCR,1,7,8,9,10 ELISA,11,(12 ) amplificación isotérmica mediada lazo LÁMPARA),13,14 entre otros,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 se han utilizado recientemente para la detección de diferentes patógenos. En comparación con bacterias tradicionales métodos de cultivo, estas técnicas son mucho más eficientes en cuanto a la especificidad y el tiempo. Sin embargo, estas técnicas aún batallan con los falsos positivos y negativos, procedimientos complejos y los costos. 1 , 3 , 25 es por este motivo que nanosensores de magneto-fluorescente multiparamétrico (MFnS) se propusieron como un método alternativo para la detección de bacteria.
Estos nanosensores únicamente par juntos relajación magnética y modalidades fluorescentes, lo que permite una plataforma de doble detección rápida y precisa. Utilizando e. coli O157: H7 como un contaminante de la muestra, se demuestra la capacidad de MFnS para detectar tan poco como 1 UFC en minutos. Anticuerpos patógenos específicos se utilizan para aumentar la especificidad, y permite la combinación de modalidades magnéticas y fluorescentes para la detección y cuantificación de contaminantes bacterianos en dos rangos de baja y alta contaminación. 16 en el caso de contaminación bacteriana, los nanosensores que pululan alrededor de las bacterias debido a las capacidades de segmentación de los anticuerpos específicos del patógeno. La unión entre las bacterias y nanosensores magnético limita la interacción entre el núcleo de hierro magnético y los protones de agua circundantes. Esto provoca un aumento en los tiempos de relajación T2, según lo registrado por un relaxometer magnético. Medida que aumenta la concentración de bacterias en solución, los nanosensores dispersan con el aumento del número de bacterias, lo que resulta en valores más bajos de la T2. Por el contrario, emisión de fluorescencia se incrementará en proporción a la concentración de bacterias, debido al mayor número de nanosensores vinculado directamente al patógeno. Centrifugación de las muestras y el aislamiento de los pellets bacterianos, sólo conservará las nanopartículas conectadas directamente a las bacterias, la eliminación de cualquier flotante nanosensores y correlacionar directamente la emisión de fluorescencia con el número de bacterias presentes en la solución. Una representación esquemática de este mecanismo se representa en la figura 1.
Esta plataforma de MFnS ha sido diseñada con proyección del punto de atención en la mente, dando por resultado características portables y de bajo costo. MFnS son estables a temperatura ambiente y sólo son necesarios en concentraciones muy bajas para la precisa detección de contaminantes bacterianos. Además, después de la síntesis, el uso de los MFnS es simple y no requiere el uso de profesionales en el campo. Por último, esta plataforma de diagnóstico permite orientación altamente personalizable, proporcionar un medio por que esta una plataforma puede usarse para detectar patógenos de todo tipo, en muchos entornos diferentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo ha sido diseñado para producir MFnS completamente funcional como simplemente como sea posible. Sin embargo, hay muchos puntos claves en el que alteración del Protocolo puede ser útil, dependiendo de la finalidad del usuario. Por ejemplo, el uso de diferentes anticuerpos permitiría atacar muchos otros patógenos. Además, este Protocolo no se limita a la utilización de anticuerpos como dirigidos a moléculas. Cualquier molécula que tiene afinidad de Unión específicos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por P20GM103418 K INBRE, Kansas soja Comisión (KSC/PSU 1663), ACS PRF 56629-UNI7 y PSU polímero química Inicio fondo todos SS. Agradecemos al camarógrafo de la Universidad, el Sr. Jacob Anselmi, por su destacada labor con el video. También agradecemos al Sr. Roger Heckert y Sra. Katha Heckert por su generoso apoyo para la investigación.
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
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