利用磁荧光纳米进行食源性致病菌筛选: 快速检测大肠杆菌O157:H7
Summary
本协议的总体目标是通过磁性松弛和荧光发射方式的结合, 合成功能性纳米, 用于便携式、cost-effective 和快速检测特定靶向致病菌。
Abstract
出大肠杆菌O157:H7 已与水和食源性疾病联系在一起, 尽管目前使用的食品和 water-screening 方法仍然存在威胁。虽然传统的细菌检测方法, 如聚合酶链反应 (PCR) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 可以明确检测致病污染物, 他们需要广泛的样本准备和漫长的等待期。此外, 这些做法需要先进的实验室仪器和设置, 必须由训练有素的专业人员执行。在此, 提出了一种简单的诊断技术的协议, 其特点是磁性和荧光参数在纳米平台的独特组合。所提出的多磁荧光纳米 (MFnS) 可以检测到在小于1小时内, 在溶液中存在的1菌落形成单元的大肠杆菌O157:H7 污染。此外, 还证实了 MFnS 在诸如牛奶和湖水等复杂介质中保持高度功能的能力。另外的特异性化验也被用来证明 MFnS 只检测特定目标细菌的能力, 即使在存在类似的细菌种类的情况下。磁性和荧光模式的配对允许检测和定量的病原体污染在广泛的浓度, 表现出其在早期和晚期污染检测的高性能。MFnS 的有效性、可承受性和可移植性使他们成为点筛选各种环境中的细菌污染物的理想候选者, 从水生水库到商业包装食品。
Introduction
在商业生产的食物和水源中, 细菌污染的持续发生, 已使人们对越来越快速和具体的诊断平台产生了需求。1,2一些更常见的细菌污染物是由沙门氏菌、葡萄球菌、李斯特菌、弧菌、志贺氏杆菌和大肠杆菌引起的。3,4这些病原体的细菌污染通常会导致发烧、霍乱、肠胃炎和腹泻等症状。4水资源的污染往往对社区造成严重和不利的影响, 无法获得足够的过滤水, 食品污染导致大量疾病和产品召回努力。5,6
为了减少因细菌污染引起的疾病的发生, 已经作出了许多努力, 以制定方法, 在销售或消费之前, 可以有效地对水和食物进行扫描。3技术, 如 PCR、1、7、8、9、10 ELISA、11、12循环介导的等温放大 (灯),13,14 ,15,16,17,18,19,20,21, 22、23、24最近被用于检测各种病原体。与传统的细菌培养方法相比, 这些技术在特异性和时间方面更有效率。然而, 这些技术仍在与虚假的正面和负面、复杂的程序和成本斗争。1,3,25正是由于这个原因, 多磁荧光纳米 (MFnS) 被提出作为细菌检测的替代方法。
这些纳米独特的配对磁松弛和荧光模式, 允许双检测平台, 既快速又准确。使用大肠杆菌O157:H7 作为样品的污染物, MFnS 在几分钟内检测到 1 CFU 的能力被证实。病原体特异抗体用于增加特异性, 并且磁性和荧光方式的组合允许检测和定量细菌污染物在两个低 high-contamination 范围。16在细菌污染的情况下, 由于特定病原体抗体的靶向能力, 纳米将围绕细菌群。磁性纳米和细菌之间的结合限制了磁性铁芯与周围的水质子之间的相互作用。这会导致 T2 松弛时间的增加, 如磁 relaxometer 所记录的那样。随着溶液中细菌浓度的升高, 纳米随细菌数量的增加而分散, 导致 T2 值降低。反之, 由于纳米直接与病原体的数量增加, 荧光辐射与细菌浓度的比例会增加。离心的样品, 和分离的细菌颗粒, 将只保存纳米颗粒直接附着在细菌, 消除任何自由漂浮的纳米, 并直接关联的荧光辐射与数量溶液中存在细菌。此机制的示意图表示形式在图 1中表示。
这个 MFnS 平台已经设计了点的筛选, 导致低成本和便携的特点。MFnS 在室温下是稳定的, 只有在非常低的浓度下才能准确检测细菌污染物。此外, 在合成后, 使用 MFnS 是简单的, 不需要在实地使用训练有素的专业人员。最后, 这个诊断平台允许高度可定制的目标, 提供一种手段, 这一平台可以用来检测各种病原体, 在许多不同的设置。
Protocol
Representative Results
Discussion
本协议的设计目的是尽可能简单地生成完全功能的 MFnS。但是, 根据用户的最终目标, 更改协议可能有用的许多关键点。例如, 使用不同的抗体可以使许多其他病原体成为靶向。此外, 本议定书不限于使用抗体作为靶分子。任何对目标病原体有特定约束力的分子, 如宿主细胞受体, 也可用作靶分子。只要靶向分子有一个主要胺或酒精组, 或可以功能化有一个, 它可能被共轭到表?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持 INBRE P20GM103418, 堪萨斯大豆委员会 (肯尼迪航天公司/电源 1663), ACS 脉冲 56629-UNI7 和电源聚合物化学启动基金, 所有的 SS。我们感谢大学摄影师, Mr. 雅各 Anselmi, 为他出色的视频工作。我们还感谢 Mr. 罗杰 Heckert 和 Mrs. 卡塔奥义 Heckert 对研究的慷慨支持。
Materials
| Ferrous Chloride Tetrahydrate | Fisher Scientific | I90-500 | |
| Ferric Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | I88-500 | |
| Ammonium Hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Polyacryllic Acid | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| EDC | Thermofisher Scientific | 22980 | |
| NHS | Fisher Scientific | AC157270250 | |
| Anti-E. coli O111 antibody | sera care | 5310-0352 | |
| Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6] | Abcam | ab75244 | |
| DiI Stain | Fisher Scientific | D282 | |
| Nutrient Broth | Difco | 233000 | |
| Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet | ATCC | 700728 | |
| Magnetic Relaxomteter | Bruker | mq20 | |
| Zetasizer | Malvern | NANO-ZS90 | |
| Plate Reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Magnetic Column | QuadroMACS | 130-090-976 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 Series | |
| Centrifuge (accuSpin Micro 17) | Fisher Scientific | 13-100-676 | |
| Floor Model Shaking Incubator | SHEL LAB | SSI5 | |
| Analytical Balance | Metler Toledo | ME104E | |
| Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Open-Air Rocking Shaker | Fisher Scientific | 02-217-765 |
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