Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için
Summary
Protein bazlı hydrogels üç boyutlu mimarisinde işlemek için farklı yöntemler burada malzeme özellikleri ile ilgili olarak değerlendirilir. Macroporous ağlar ile bir hücre yapışkanlı peptid functionalized ve onların fizibilite hücre kültüründe iki farklı model hücre hatları kullanılarak hesaplandı.
Abstract
Hydrogels hücre kültür uygulamaları nedeniyle son derece sulu hücre ortamları sağlamak için yeteneklerini için umut verici malzemeler kabul edilmektedir. 3D şablonların alan bu malzemeleri potansiyel benzerliği nedeniyle doğal hücre dışı matriks artıyor. Protein bazlı hydrogels özellikle umut verici, çünkü onlar kolayca functionalized ve ayarlanabilir fizikokimyasal özellikleri ile tanımlanmış yapılar elde edebilirsiniz. Ancak, üretim macroporous 3D şablonların doğal malzemeler kullanarak hücre kültür uygulamalar için genellikle sentetik malzemeler için göre daha zayıf mekanik özellikleri ile sınırlıdır. Burada, farklı yöntemler macroporous sığır serum albumin (BSA) üretmek için değerlendirildi-ayarlanabilir gözenek boyutları 10-70 µm çapındaki yelpazesi ile hidrojel sistemleri dayalı. Ayrıca, birkaç yüz mikron uzun olan bu protein bazlı malzeme kanalları oluşturmak için bir yöntem kuruldu. Gözenekleri gözenek boyutu oranı, pH, sıcaklık kararlılığı ve enzimatik bozulması davranış, şişme gibi malzeme özellikleri üzerinde etkisi üretmek için farklı yöntemler analiz edildi. Gözenek boyutları confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak hydrogels yerli, şişmiş durumda araştırıldı. Hücre kültür uygulamaları için fizibilite bir hücre yapışkanlı RGD peptid değiştirme-in protein sistemi ve iki modeli hücre satırları kullanarak değerlendirildi: insan meme kanseri hücreleri (A549) ve adenocarcinomic insan alveoler Bazal epitelyal hücreler (MCF7).
Introduction
Hydrogels çözünmez 3D ağlar büyük miktarda su bağlama yeteneğine sahip formu malzemelerdir. Bu materyalleri canlı hücreler için mükemmel çevre koşulları sağlayabilir. Şu anda, orada ilgi üç boyutlu hidrojel yapıları nesil ve onların kimyasal ve fiziksel özellikleri terzi süreçlerinin geliştirme artmaktadır. Bir kez bu elde edilir, hücrelerinin büyümesini ve hücresel davranış manipülasyon için şablon oluşturulan1,2,3,4olabilir. Bu 3D yapılar sadece bir daha doğal ve gerçekçi daha geleneksel iki boyutlu yaklaşımlar, ama onlar da reveal kök hücrelerin büyüme için yeni olanaklar ortamı veya tümör5modelleri. Farklı malzeme esas olarak jel6gözenek boyutu üzerine bağlıdır özellikleri bir dizi sahip. Gözenekleri hücre kültür uygulamaları, doku Mühendisliği ve kök hücrelerin yönlendirilmiş büyüme çok önemli bir rol oynamaktadır. Örneğin, oksijen ve besin matris ile diffüz ve yeterli miktarda hücreleri7ulaşmak mümkün olması gerekir. Öte yandan, zararlı metabolitleri kısa zamanda kaldırılması ve hücre büyümesi için yeterli alanı7kullanılabilir olması gerekir. Sonuç olarak, malzeme ve böylece gözenek boyutu özelliklerini ciddi potansiyel yararı ve olası uygulamalar Matrix etkisi. Malzeme özellikleri bağlı olarak, farklı hücre büyüme süreçleri nöronal yapıların oluşumu da dahil olmak üzere 3D hücre kültüründe ortaya çıkabilir; büyüme ve farklılaşma deri ya da kemik hücreleri; ve tetkikine veya fibroblastlar2,3,8,9,10,11gibi özel kök hücre satırları yönlendirilmiş büyüme. Başka bir önemli nokta bir malzeme mümkün uygulanması etkileyen istikrarı dış uyaranlara12doğru olduğunu. Örneğin, hidrojel mekanik bütünlüğünü hücre kültür medya veya insan vücudu korumak gerekir.
Son yıllarda yoğun 3D hücre kültür hydrogels üzerinde araştırma ve birçok çalışma sistemleri133D mimarileri çözmek için yapılmıştır. Hydrogels kimyasal olarak sentezlenmiş bileşenlerden oluşur çünkü kolayca sentezlenmiş ve kimyasal olarak değiştirilmiş ve onlar yüksek kararlılık göstermek en yaygın olarak incelenmiştir (bkz: Zhu vd., 2011 için bir daha gözden geçirme)5. Ancak, proteinler birçok yararlı özellikleri var: kadar sözde “hassas polimerler,” onlar Biyouyumlu; Onlar tanımlanmış bir uzunluğu var; Onlar değiştirmek nispeten kolaydır; ve onlar-si olmak çok sayıda hedef siteleri14,15. Bu bağlamda, çok özel, yenilikçi yapıları çok alanda uygulama için oluşturulabilir. Bu çalışmada, bir protein bazlı hidrojel16 3D mimari malzeme etkilemek için köklü yöntemlerden yeteneğini göstermek için kullanıldı. Ayrıca, yeteneği ve gözenek üretimi uygulanabilirliği da araştırıldı.
Çok farklı teknikler basit yöntemleri ve malzeme bilimi farklı alanlardan sofistike, alanında son derece uzman teknikleri dahil olmak üzere 3D yapılar değiştirmek kullanılabilir. İyi tanımlanmış yapılar17oluşturmak için electrospinning kullanımı yaygın bir tekniktir. Şarj edilmiş lifler bir çözümden bir elektrik alanı tarafından alınır ve oksijen maruz üzerine kuvvetlendirmek. Bu şekilde, lifleri birkaç nanometre kadar birkaç mikron aralığındaki üretilebilir. Boyutu, yapısı ve gözenekleri matris içinde dağılımını ayarlamak için ek teknikler vardır yumuşak litografi, fotolitografi, hidrodinamik odaklama, elektro-püskürtme ve biyo-baskı18,19,20. Bu tekniklerin önemli bir dezavantajı özel, pahalı ekipman ve özel kimyasallar veya malzeme üzerine kendi bağımlılık olduğunu. Ayrıca, bu teknikleri ile deneyim çoğu zaman doğrudan protein bazlı malzeme için transferrable değildir ve birçok kimyasal madde ve yöntemleri hücre uyumlu değildir.
Öte yandan, birçok teknik yapım onları daha kolay ve ucuz uygulamak için ve yeniden üretmek için özel ekipman güvenmeyin. Yapısı manipülasyon için yaygın bir yöntem solvent döküm21,22,23‘ tür. Parçacıklar polimerizasyon reaksiyonu önce eklenir ve homojen çözüm emdirmek dağıtılır. Gözenekleri malzeme içinde kalırken polimerizasyon sonra parçacıkların solvasyon bir seyreltme veya bir pH değişikliği gibi koşulları değişimine yol açar. Tuz, şeker, parafin, jelatin ve tebeşir, gibi bu teknikleri kullanılan kimyasalların ucuz ve kullanılabilir durumda. Dağılması, şişmiş hydrogels dondu. Bir vakum altında sıvı aşamadan sonraki süblimasyon ise23,24,25gerçekleştirilen. Su süblimasyon ağdan malzemenin belirli 3D yapıları korumak için nazik. Polimerizasyon gözenekleri jel21içinde bırakarak gerçekleştikten çalışırken köpük gaz, gaz ile bir çözüm akışla gönderilir. Gözenekleri dağılımı ve boyutu gaz akışı bağlı olarak ayarlanabilir.
Protein hidrojel oluşturmak için BSA ile tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC) Birincil aminler ve dört kollu bağlayıcı molekül26hidroksi grupları arasında Kovalent bağlar oluşumu için izin vermek için bir Mannich tipi tepki tepki. Reaksiyon oluştuktan sonra olası zararlı ara malzeme aşırı yıkama tarafından kaldırılır.
Bu çalışmada BSA-esaslı malzeme işlemek ve gözenekleri boyutunu terzi için farklı teknikler ile tedavi olasılığını gösterir. Hiçbir özel ekipman gerekli olduğu gibi tekniklerin herbirini herhangi bir laboratuvar olarak dünya çapında kullanılabilir. Şişme oranı, enzimatik çözünebilirlik, pH istikrar ve sıcaklık hassasiyeti, muayene ve her diğer, karşılaştırıldığında gibi Ayrıca, farklı parametreleri, özellikle farklı teknikleri etkisi için 3D mimarileri nesil üzerinde saygı duyuyorum. Son olarak, malzemeler ile hücre kültürü mümkün uygulamaya malzemelerin araştırmak için hücre yapışkanlı peptidler functionalized. İki farklı model hücre satır kullanılmıştır: A549 ve MCF7.
Protocol
Representative Results
Discussion
The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Baden-Württemberg Stiftung (BioMatS-14) “Bioinspired malzeme sentezi” çerçevesinde finansal destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (high glucose) | Life Technologies / Thermo Fisher | 11140-050 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies / Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies / Thermo Fisher | 15140122 | |
| MEM Nonessential Amino Acid Solution | Sigma Aldrich | M7145-100ML | |
| Trypsin EDTA 0.05 % Phenol Red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Ölfabrik Schmidt | 2133 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| Albumin Fraction V | Carl Roth | 3854.2 | |
| THPC | Sigma Aldrich | 404861-100ML | Toxic |
| 0.1 % Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Slightly toxic |
| Phalloidin-rhodamine | Life Technologies / Thermo Fisher | R415 | |
| 3.7 % Formaldehyde | Life Technologies / Thermo Fisher | F8775-25ML | Toxic |
| Rhodamine B | Sigma Aldrich | 81-88-9 | |
| Filtropur S 0.2, | Sarsted Ag und Co. | 2 83.1826.001 | |
| µ slide 8 well | Ibidi GmbH | 80826 | |
| KCSSGKSRGDS peptide | UPEP Ulm | Custom sysnthesis | |
| Ethanol 99.8 %, vergällt | Carl Roth | K928.5 | |
| Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 50 ml | Sarsted Ag und Co. | 62.547.254 | |
| Tubes 1,5 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,690,001 | |
| Tubes 2 ml | Sarsted Ag und Co. | 72,691 | |
| CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM | Greiner | 655073 | |
| FreezeDryer Epsilon 1-6D, | Christ, Osterode am Harz, Germany | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484 | Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7 | GSA GmbH |
References
- Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).
- Liu, Y., Chan-Park, M. B. A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture. Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).
- Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
- Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation. Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).
- Samaryk, V., et al. Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties. J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).
- Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).
- Park, H., Guo, X., et al. Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).
- Stokols, S., Tuszynski, M. H. The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury. Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).
- Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
- Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose. Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).
- Chiu, Y. -. C., Kocagöz, S., Larson, J. C., Brey, E. M. Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation. PloS One. 8 (4), e60728 (2013).
- Jonker, A. M., Löwik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Peptide- and Protein-Based Hydrogels. Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).
- Bodenberger, N., et al. Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker’s yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices. Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).
- Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties. Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).
- Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. Use of electrospinning technique for biomedical applications. Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).
- Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).
- Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds. Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).
- Selimović, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels. Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).
- Annabi, N., Nichol, J. W., et al. Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
- Bodenberger, N., et al. Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge. Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).
- Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial. Sci Rep. 5, 15977 (2015).
- Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. Novel crosslinking methods to design hydrogels. Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).
- Caló, E., Khutoryanskiy, V. V. Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products. Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).
- Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer. Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).
- Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. Microspheres leaching for scaffold porosity control. J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).
- Whang, K., et al. Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture. Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).
- Ziv, K., et al. A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation. Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).
- Butruk-Raszeja, B. A., et al. Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices–Examination of biological properties. Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).
- Lü, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization. Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).
- Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science. 238 (4826), 491-497 (1987).
