Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

Idrogeli sono materiali che formano reti 3D insolubile in grado di legare grandi quantità di acqua. Tali materiali in grado di fornire ottime condizioni ambientali per le cellule viventi. Attualmente, vi è crescente interesse nella generazione di strutture tridimensionali idrogel e nello sviluppo di processi per adattare i loro proprietà chimiche e fisiche. Una volta che questo è realizzato, un modello per la crescita delle cellule e la manipolazione del comportamento cellulare può essere generato^1,2,3,4. Queste strutture 3D non solo creano un ambiente più naturale e realistico che approcci convenzionali bidimensionali, ma loro anche rivelare nuove possibilità per la crescita delle cellule staminali o tumore modelli⁵. Diversi materiali possiedono una gamma di caratteristiche che dipendono principalmente la dimensione dei pori del gel⁶. I pori giocano un ruolo cruciale nelle applicazioni della coltura delle cellule, l’ingegneria dei tessuti e la crescita delle cellule staminali diretta. Ad esempio, ossigeno e sostanze nutritive si diffondono attraverso la matrice, e gli importi adeguati devono essere in grado di raggiungere le cellule⁷. D’altra parte, metaboliti nocivi devono essere rimossi nel minor tempo possibile, e spazio sufficiente per la crescita delle cellule deve essere disponibile⁷. Di conseguenza, le proprietà del materiale e così la dimensione dei pori, gravemente influenzano le applicazioni potenziali benefici e possibili della matrice. Processi di crescita delle cellule differenti dipendendo le proprietà del materiale, possono verificarsi nella coltura cellulare 3D, compresa la formazione di strutture di un neurone; la crescita e la differenziazione delle cellule della pelle o dell’osso; e la crescita diretta delle linee speciali sulle cellule staminali, come gli epatociti o fibroblasti^{2,3,8,9,10,11}. Un altro punto cruciale che influenzano l’eventuale applicazione di un materiale è la sua stabilità verso stimoli esterni¹². Ad esempio, l’idrogel deve mantenere la sua integrità meccanica in terreni di coltura delle cellule o il corpo umano.

Negli ultimi anni, ricerca sul cellulare 3D cultura idrogeli intensificati, e molti studi sono stati effettuati per risolvere le architetture 3D dei sistemi¹³. Idrogeli composti di componenti chimicamente sintetizzati sono più comunemente studiati perché possono essere facilmente sintetizzati e modificati chimicamente ed esibiscono alta stabilità (Vedi Zhu et al., 2011 per una recensione)⁵. Tuttavia, le proteine hanno molte proprietà benefiche: come cosiddetto “polimeri di precisione”, sono biocompatibili; hanno una lunghezza definita; sono relativamente facili da modificare; e hanno un gran numero di destinazione siti^14,15. A questo proposito, le strutture altamente specifiche, innovative possono essere generate per applicazione in molti campi. In questo studio, un idrogel a base di proteine¹⁶ è stato utilizzato per dimostrare la capacità dei metodi consolidati per influenzare l’architettura 3D del materiale. Inoltre, la capacità di e l’applicabilità al poro generazione inoltre è stata studiata.

Diverse tecniche sono disponibili per modificare le strutture 3D, inclusi sia metodi semplici e sofisticate, altamente specializzate tecniche provenienti da diversi campi della scienza dei materiali. Una tecnica diffusa è l’uso di elettrofilatura per generare strutture ben definite¹⁷. Carica le fibre vengono estratti da una soluzione da un campo elettrico e quindi solidificano sopra l’esposizione all’ossigeno. In questo modo, possono essere prodotte fibre nella gamma di diversi nanometri fino a parecchi micron. Ulteriori tecniche per ottimizzare le dimensioni, la struttura e la distribuzione dei pori all’interno della matrice sono litografia soft, fotolitografia, focalizzazione idrodinamica, electro-spruzzatura e bio-stampa^18,19,20. Un notevole svantaggio di queste tecniche è la loro dipendenza specifiche, costose apparecchiature e prodotti chimici speciali o materiali. Inoltre, l’esperienza con queste tecniche spesso non è direttamente trasferibile ai materiali a base di proteine, e molte delle sostanze chimiche e metodi non sono cellulare compatibile.

D’altra parte, molte tecniche non fare affidamento su attrezzature speciali, che li rende più facile e più conveniente di applicare e di riprodurre. Un metodo diffuso per la manipolazione di struttura è colata solvente^21,22,23. Le particelle vengono aggiunti prima della reazione di polimerizzazione e sono distribuite in modo omogeneo per saturare la soluzione. Dopo la polimerizzazione, un cambiamento delle circostanze, ad esempio una diluizione o un cambiamento di pH, conduce alla solvatazione delle particelle, mentre i pori rimangono all’interno del materiale. I prodotti chimici usati in queste tecniche, come sale, zucchero, paraffina, gelatina e gesso, sono a buon mercato e facilmente reperibili. Nella liofilizzazione, idrogeli gonfiati sono congelati. La successiva sublimazione delle fasi liquidi sotto vuoto è quindi eseguito^23,24,25. Sublimazione di acqua dalla rete è abbastanza delicato per mantenere le strutture 3D specifiche del materiale. Nel gas di schiumatura, una soluzione è in streaming con un gas mentre la polimerizzazione avviene, lasciando i pori all’interno del gel di²¹. La dimensione e la distribuzione dei pori può essere regolate a seconda del flusso di gas.

Per formare la proteina idrogel, BSA viene fatto reagire con cloruro di tetrachis (idrossimetil) fosfonio (THPC) in una reazione di Mannich-tipo per consentire la formazione di legami covalenti tra le ammine primarie e i gruppi idrossi della molecola del linker quattro braccia²⁶. Eventuali intermedi reattivi nocivi vengono rimossi mediante lavaggio eccessivo del materiale dopo la reazione si verifica.

Questo studio dimostra la possibilità di trattare un materiale a base di BSA con diverse tecniche per manipolare e adattare la dimensione dei pori. Ciascuna delle tecniche può essere utilizzato in qualsiasi laboratorio in tutto il mondo, come nessuna attrezzatura speciale è necessaria. Inoltre, diversi parametri, come rapporto di gonfiore, degradabilità enzimatica, stabilità del pH e la sensibilità di temperatura, esaminati e confrontati tra loro, soprattutto rispettano all’influenza delle diverse tecniche sulla generazione di architetture 3D. Infine, i materiali sono stati funzionalizzati con peptidi di cella-adesivo per indagare la possibile applicazione dei materiali in coltura cellulare. Due linee di cellule di diverso modello sono stati utilizzati: A549 e MCF7.