Öğrenme ve Bellek Tedrisi Olan Drosophila Kurbanlığı İklimlendirme
Summary
Bu protokol, kur şartlama denilen bir Drosophila öğrenme ve bellek deneyi tanımlar. Bu klasik tahlil, resepsiyona açık olmayan prematüre bir kadının cinsel reddetmesinden sonra erkek kovuşturma davranışının azaltılmasına dayanmaktadır. Davranışsal esnekliğin bu doğal biçimi, öğrenmeyi, kısa vadeli belleği ve uzun süreli belleği test etmek için kullanılabilir.
Abstract
Öğrenme ve hafızanın altında yatan moleküler mekanizmalara dair pek çok anlayış, meyve sineği, Drosophila melanogaster gibi model organizmalarda basit davranışsal tahliller kullanılarak aydınlatılmıştır . Drosophila , zihinsel engellilik (ID) ve otizm gibi insan bilişsel bozukluklarıyla ilişkili genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanan kognitif defisitlerin altında yatan temel nevrobiyolojiyi anlamada kullanışlıdır. Bu eser, kur yapma koşulları olarak bilinen Drosophila'da klasik bir paradigmayı kullanarak öğrenme ve hafızayı test etmeye yönelik bir metodoloji anlatıyor. Erkek, kolayca fark edilebilen farklı davranış modelleri kullanarak kadınları mahkemeye gönderir. Prematüre dişiler çiftleşmeye karşı değildir ve erkeklerin kopyalanma girişimlerini reddedecektir. Bu reddetme karşısında, erkek sinekleri kur davranışlarını azaltmaktadır. Kur-ötesi davranışında azalmanın öğrendiği öğrenme ve hafızanın bir göstergesi olarak görev yapan, zaman içerisinde ölçülür. Temel numeBu tahlilin rical çıktısı, bir erkeğin 10 dakikalık bir süre boyunca dövüşerek geçirdiği süre yüzdesi olarak tanımlanan kurluk endeksidir (CI). Öğrenme indeksi (LI), öncül bir kadına maruz kalan sineklerdeki CI'nin, naif sineklere kıyasla önceki sosyal karşılaşmalar olmaksızın göreli azalmasıdır. Genotipler arasındaki LI'lerin istatistiksel karşılaştırması için, önyüklemeli bir randomizasyon testi kullanılır. Testin, öğrenme ve hafızayla ilgili bir genin rolünü belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için burada Dihidroksiaseton fosfat açiltransferazın ( Dhap-at ) pan-nöronal knockdown'u karakterize edildi . Dhap-at , glisero-nosfosfat O-açiltransferaz ( GNPT ) insan ortologu, ciddi ID ile karakterize edilen otozomal resesif geçiş sendromu olan rhizomelik kondrodisplazi punktata tip 2'de yer alır. Kurum koşullama analizini kullanarak, uzun süreli bellek için Dhap-at'ın gerekli olduğu, ancakkısa süreli hafıza. Bu sonuç, altta yatan moleküler mekanizmaların daha fazla araştırılması için bir temel oluşturmaktadır.
Introduction
Öğrenme ve hafızanın altında yatan moleküler mekanizmalar birçok türde korunmaktadır. Koku alma ve hafızadaki kusurlar için Drosophila melanogaster mutant hatlarını öncü çalışma taraması, öğrenme ve hafızanın altında yatan süreçlere temel moleküler anlayışlar sağlamıştır 1 . Bu çalışmalar rutabaga 2 , amnesiak 3 ve dunce 4 gibi öğrenme ve hafıza ile ilgili ilk genlerden bazılarını saptadılar ve siklik adenosin monofosfat (cAMP) sinyal verme kritik rolünü ortaya koydu5.
Hafıza mutantları için erken genetik ekranlar öncelikle koku alma sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, öğrenme ve hafızanın diğer biçimlerini ölçmek için çeşitli yöntemler zamanla ortaya çıkmıştır. En yaygın kullanılan öğrenme ve bellek paradigmalarından biri ve burada açıklanan tahlil, c olarak bilinirIlk olarak Siegel ve Salon 6 tarafından tanımlanan ve daha sonra birkaç diğer araştırma grubu 7 , 8 , 9 tarafından rafine edildi. Courtship condition, kadın karnında erkek tarafından copülasyon sırasında bırakılan spesifik bir feromon, cis- vaccenyl acetate (cVA) varlığına bağlıdır. Kadın karnındaki cVA'yı algılama, kurban davranışını doğal olarak düşürür ve kadın tarafından reddetme eylemiyle birleşince cVA'nın erkek kurban azaltma üzerindeki etkisi çarpıcı bir şekilde artırılır. Bu tahlilde erkek sineklerin cevabı, kadına yönelip onları takip ederek, kanadı vurarak, uzatarak ve titreşerek, yalamayla ve kopülasyon denemesiyle karakterize edilen farklı kur davranışlarını gözlemleyerek kolaylıkla nicelleştirilebilir 10 ( Şekil 1A ). Erkek sinekler distinguis öğrenirler. H, cinsel reddedildikten sonra 9 gün 8'e kadar resepsiyona açık olmayan dişilere yönelik kur davranışlarını azaltır. Bu doğal davranış, öğrenmenin altında yatan mekanizmaları, kısa süreli hafızayı (STM) ve uzun süreli hafızayı (LTM) aydınlatmak için kullanılabilir 8,9,12. Öğrenme, eğitim süresince ortaya çıkan kur davranışında derhal azalma olarak tanımlanır ve çiftleşmiş bir kadına 6 , 8 maruz kaldıktan sonra 0 – 30 dakika ölçülen anında hatırlama belleği olarak adlandırılır. STM, antreman sonrası 30 dakika ile 1 saat arasında ölçülürken, LTM en sık antreman 24 saat sonra ölçülür ( Şekil 1B ). STM, 1 saatlik bir eğitim periyodu kullanılarak indüklenebilir, ancak 2-3 saat sürerS = "xref"> 6 , 8 . Çoğu öğrenme paradigmasında, LTM yalnızca aralıklı tekrarlanan eğitimlerle tetiklenebilir. Mcbride ve ark . (1999) 8 , aralıksız, 1 saatlik egzersiz seanslarının, 1 saatlik bir eğitim seansının neden olduğu 2-3 saatin aksine, 9 güne kadar sürecek kur ilkesi uygulamak için yeterli olduğunu gösterdi. McBride ve ark . 8 , tek bir 5 saatlik eğitim oturumunun 9 güne kadar benzer bir LTM yanıtı verdiğini de gösterdi. Sinekler, bu 5 saatlik sürede sürekli mahkemeye çıkmazlar, aslında tek bir eğitim oturumunda LTM'yi teşvik etmek için kendi aralıklı eğitimlerini üretirler. Bu, LTM'yi araştırmak için bu tahlildeki kolaylığı artırarak, pratik bir perspektiften çok önemlidir. Mevcut protokoller ağırlıklı olarak LTM 11 , 12 için 7 saatlik tek bir eğitim oturumu kullanır. Çeşitli çalışmalar çeşitli araştırmalar yapmıştır.Kurban öğrenmesinin farklı yönlerinde belirli kusurlara sahip mutant koşullar. Örneğin, mantar vücut ablasyonu STM'yi ve LTM'yi etkiler, ancak öğrenmeyebilir8. Olfaktif kondisyonlama 3'ü kullanarak belleğin spesifik bir regülatörü olarak tanımlanan amnesiak genindeki mutasyonlar STM'yi etkiler ancak öğrenmeyi etkilemez 6 . Çeviri regülatörü orb2'nin (oo18 RNA-bağlama (orb) CPEB2 alt ailesi) bozunması ve ekdison sinyali sadece LTM 9 , 13'ü etkiler. Böylece, kur şartlama, öğrenmenin ve hafızanın farklı aşamalarının altında yatan mekanizmaları incelemek için yararlı bir paradigmadır.
Bu çalışma, kur şartlama koşullarının nispeten yüksek verim testine olanak tanıyan optimize edilmiş bir deney düzeneğini göstermektedir. Ayrıca, istatistiksel analiz betiğini açıklar ve tahlilin kritik faktörlerini tartışır. ÖyleBurada kendi, Drosophila geni Dihidroksiaseton fosfat açiltransferaz ( Dhap-at ) LTM için nöronlarda gereklidir, ancak STM için gerekli değildir. Bu genin insan ortologu gliseronfosfat O-açiltransferaz ( GNPAT ), şiddetli zihinsel engellilik, nöbetler ve birkaç diğer klinik özellik ile karakterize otozomal resesif geçişli bir bozukluk olan rhizomelik kondrodisplazi punktata tip 14'te mutasyona uğramıştır. Bu bağlamda, kantite şartlandırma, mekanik çalışmalar için bir temel oluşturan öğrenme ve bellekte insan hastalık genlerinin rolünü fonksiyonel olarak doğrulamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kort şartlandırma tahlili, Drosophila'daki öğrenme ve hafızayı analiz etmek için klasik bir paradigmadır . Burada sunulan protokol, daha önce 6 , 7 , 8 , 9'da açıklanan genel metodolojiyi izlemektedir , ancak pratik kılavuzlar, özel ekipman ve randomizasyon testleri için bir veri analiz scripti 9 , 12 gibi benzersiz yönleri içermektedir. Bu protokolü kullanarak, erkek toplamak ve eğitmek için çok sayıda sinek paralel olarak 96 yuvalı düz alt bloklar ( Şekil 2A ) kullanılarak analiz etmek mümkündür. Bloklar, PCR yapışkanlı film ile sızdırmaz hale getirildi, bu da sineklerin kolayca erişilebilir olmasını sağlıyor. Buna ek olarak, burada açıklanan eşsiz kur odalarında 18 erkek-dişi çifti eşzamanlı olarak iki boyutlu bir alanda eşleştirmek mümkündür.Video analizi için idealdir. Özel tasarım courtship odaları kullanımı kolaydır ve bir bina planı vardır ( Dosya S1 , Şekil 2D ). Test konularını toplamak için kullanılan kültürlerin kurulmasından bu video verilerinin edinilmesine kadar olan bu protokol, yaklaşık 20 gün sürer ( Tablo 1 ). Video verilerinin analizi için ek süre gereklidir. Deneyimlerimize göre, STM tahlili son derece sağlamdır. LTM tahlili de oldukça sağlam ancak karışık çevre değişkenlerine karşı daha duyarlıdır ve bu nedenle ustalığı zorlaşabilir.
Hayvan davranışı oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, bu varyansı azaltmak için protokoldeki kritik adımlar özenle yapılmalıdır. Öncelikle, aspiratörün nazikçe kullanılması ( Şekil 2B ) kaba kullanım veya çok fazla üfleme ile uygulanan stresini azaltacaktır. Bireysel transferi için önerilen bir yöntemAspiratörden çıkan sinekler negatif jeotaksi kullanmaktır. Sinekler yukarıya doğru eğilim gösterdikçe, aspiratörün ucunu yukarıya doğru itebilir; Sinek uca ulaşmadan hemen önce sineklerin dışarı atılmasına nazik bir darbe yeterlidir. Ayrıca, testten önce erkekleri mahkeme odalarına sokmak için genellikle bir darbe gerekli değildir.
Bir diğer önemli adım ise, erkek deneklerin toplanması ve üretilmesidir. Bütün erkekler çok genç olduklarında ve toplumsal olarak naif olduklarında toplanmalıdır. Bu, eklosiyonun zirve dönemlerinde sık sık toplanarak elde edilebilir (aşama 5.2). Erkekler bu sıkı zaman diliminde toplanmazlarsa, erkenden sosyal etkileşime geçebilirler; bu da, öğrenmenin zayıf olduğu veya CI'de değişkenlik gösterebilir. Erkek deneklerin değerlendirilmesi gereken bir diğer faktör de genetik geçmiştir. Farklı genetik geçmişler farklı düzeylerde saf naiplik sergileyecek ve genel aktivite veya lokomotor yeteneği açısından farklılık gösterebilir. Ne zaman compaÇok sayıda genotipi çalarlarsa, LI puanlarını etkileyebilecek bu karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için genetik geçmişle ilgili özen gösterilmelidir. Ek olarak, CI verilerinin dağılımı dikkatle değerlendirilmelidir. CI verileri, genotipe veya diğer çevresel faktörlere bağlı olarak hem parametrik hem de parametrik olmayabilir. Bazı durumlarda, CI dağılımı normal dağılımdan çarpıcı bir şekilde çarpıtılmışsa, LI hesaplamaları için ortalama yerine medyan CI kullanmak daha iyi olabilir. Bununla birlikte, tecrübelerimize göre, medyan veya ortalama CI kullanımı, verilerin istatistiksel yorumlanmasında bir fark oluşturmaz ve ortalama CI kullanımı, literatürdeki yaygın uygulamadır.
Başarılı kur kurumu için, eğitim öncesi kadınlar tarafından yapılan erkek kur yapma girişimlerinin aktif olarak reddedilmesi çok önemlidir. Bu tahlilde kullanılan prematüre dişilerin etkili bir şekilde çiftleştiğinden emin olmak önemlidir veBöylece kopyalanmaya izin verilmez. Bu ön hazırlık, 4. aşamada hazırlanan çiftleşme flakonlarında, erkek ve dişi sürgünlerin 4 gün boyunca bir araya getirildiği yerlerde kurulmuştur ( Tablo 1 ). Ardından, çiftleşme, test videolarının düzenli incelenmesi ve eğitim sırasında erkek-dişi çiftlerin gözlenmesi ile izlenebilir. Eğer çiftleşme meydana gelirse, prematüre dişilerin hazırlanması sırasında alınabilecek birkaç önlem var. Öncelikle, prematüre dişiler en uygun üreme koşullarında yetiştirilmelidir. Şişeler maya macunu ve potansiyel çiftleşme yüzeylerini arttırmak için katlanmış bir filtre kağıdı ile desteklenebilir. Sineklerin burada açıklanan koşullar altında inkubasyonu, geçmişte sağlam öngörülemeyen dişiler üretti, ancak bu farklı laboratuarda ve farklı genetik soyların kullanımı ile farklılık gösterebilir. Bu nedenle, inkübe etme zaman ve koşullarını değiştirerek prematüre dişilerin üretimini optimize etmek gerekebilir.
Kurban davranışının nicelenmesiBu protokolde başka bir kritik adım. Bu, elle veya otomatik olarak özel yazılım programları kullanılarak yapılabilir 9 . Otomatik niceleme hızlıdır ve prensipte tarafsızdır. Birçok program yayınlandı 21 , 22 , 23 ; Bununla birlikte, kullanımı kolay değildir, çoğu zaman özel video formatları ve ileri hesaplama becerileri gerektirir. Manuel sayısallaştırma kolay ve doğrudur, ancak çok emek yoğun ve bireysel değişkenlik ve önyargıya tabidir. Bu protokolün, CI'lerin otomatik olarak ölçülmesi için potansiyel olarak gerekli olan video biçimlendirme gereksinimlerini karşılamadığını vurgulamak önemlidir. Manuel sayım yapmak için, kur yapma davranışını doğru bir şekilde izlemek için yeterli kalitede bir video üretme potansiyeli olan herhangi bir basit video kayıt cihazı kullanın. Otomatik kantifikasyon için muhtemelen farklı olacaktırGereksinimlerini yazılıma bağlı olarak değiştirebilir ve otomatik kantifikasyon isteniyorsa kullanıcıların bunu kapsamlı bir şekilde araştırmaları gerekir.
Sineklerin genetik manipülasyonu için kullanılabilen kapsamlı araçlar ile birlikte, kur şartlama tahlili, öğrenme ve bellek ile ilgili moleküler mekanizmaları ve nöronal ağları incelemek için kullanılabilecek sağlam bir okuma sağlar.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Drosophila suşlarının sağlanması için Viyana Drosophila Kaynak Merkezi'ni kabul ediyoruz . Ayrıca, bu çalışmada Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (NIH P40OD018537) elde edilen stoklar kullanılmıştır. Bu araştırma, kısmen Avrupa Birliği'nin FP7 büyük ölçekli entegre bir ağ Gencodys'den KK, HvB ve AS'ye ve NSERC Discovery ve CIHR Proje Bağışları tarafından JMK'ye desteklenmiştir.
Materials
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | – | – | Any sharp will do |
| Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | – | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – | ||
| Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | – | |
| Corn flour | de Molen | – | |
| Sugar | de Molen | – | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – |
References
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
