Дрозофила в качестве меры обучения и памяти
Summary
Этот протокол описывает исследование обучения и памяти Drosophila, называемое обучением ухаживания. Этот классический анализ основан на сокращении мужского поведения ухаживания после сексуального отторжения невосприимчивой женщиной. Эта естественная форма поведенческой пластичности может быть использована для тестирования обучения, краткосрочной памяти и долговременной памяти.
Abstract
Многие идеи о молекулярных механизмах, лежащих в основе обучения и памяти, были выяснены с помощью простых поведенческих анализов в модельных организмах, таких как фруктовая муха, Drosophila melanogaster . Drosophila полезен для понимания основной нейробиологии, лежащей в основе когнитивных дефицитов, вызванных мутациями в генах, связанных с человеческими когнитивными расстройствами, такими как интеллектуальная инвалидность (ID) и аутизм. В этой работе описывается методология тестирования обучения и памяти с использованием классической парадигмы в Drosophila , известной как обустройство ухаживания. Самцы мух судака, используя четкую картину легко узнаваемых поведений. Препаренные самки не восприимчивы к спариванию и отказываются от попыток копуляции мужчин. В ответ на это отклонение мужские мухи уменьшают свое поведение по ухаживанию. Это научное сокращение поведения ухаживания измеряется с течением времени, выступая в качестве индикатора обучения и памяти. Основное числоРезультатом этого анализа является индекс ухаживания (CI), который определяется как процент времени, в течение которого мужчина проводит ухаживание в течение 10-минутного интервала. Индекс обучения (LI) является относительным уменьшением CI у мух, которые были подвержены домашней женщине по сравнению с наивными мухами без предыдущих социальных контактов. Для статистического сравнения LI между генотипами используется тест рандомизации с начальной загрузкой. Чтобы проиллюстрировать, как анализ может быть использован для решения роли гена, связанного с обучением и памятью, здесь характеризовался пан-нейронный нокдаун дигидроксиацетонфосфат-ацилтрансферазы ( Dhap-at ). Человеческий ортолог Dhap-at , глицерофосфатная O-ацилтрансфераза ( GNPT ) участвует в ризомелиновой хондродиплазии punctata типа 2, аутосомно-рецессивный синдром, характеризующийся тяжелым ID. Используя анализ кондиционирования ухаживания, было установлено, что Dhap-at требуется для долговременной памяти, но не длякраткосрочная память. Этот результат служит основой для дальнейшего изучения лежащих в основе молекулярных механизмов.
Introduction
Молекулярные механизмы, лежащие в основе обучения и памяти, сохраняются во многих видах. Пионерская работа по скринингу мутанта Drosophila melanogaster для дефектов обонятельного обучения и памяти обеспечила ключевую молекулярную информацию о процессах, лежащих в основе обучения и памяти 1 . В этих исследованиях были обнаружены некоторые из первых генов, участвующих в обучении и памяти, таких как рутабага 2 , амнезия 3 и dunce 4 , выявляющие критическую роль для сигнализации 5 циклического аденозинмонофосфата (цАМФ).
Ранние генетические экраны для мутантов памяти были в основном проведены с использованием обонятельной кондиции. Однако с течением времени появилось несколько методов измерения других форм обучения и памяти. Одна из наиболее широко используемых парадигм обучения и памяти и описанный здесь анализ известен как cКоторый впервые был описан Зигелем и Холл 6, а позже был усовершенствован несколькими другими исследовательскими группами 7 , 8 , 9 . Кондиционирование суставов зависит от присутствия специфического феромона, цис- ваккенилацетата (cVA) на женском животе, который осаждается самцом во время спаривания. Наблюдение cVA на женском животе естественно снижает ухаживающее поведение, и в сочетании с актом отклонения женского пола эффект cVA на сокращение ухаживания мужчин значительно увеличивается. Реакция мужских мух в этом анализе может быть легко определена количественно, наблюдая их четкое поведение ухаживания, которое характеризуется ориентацией на женщину и ее последующим выступом, растяжением и вибрацией крыла, лизанием и попыткой совокупления 10 ( рисунок 1A ). Мужские мухи учатся различать Ч между восприимчивой девственницей и невосприимчивыми матерями-женщинами 11 , а после полового отторжения они демонстрируют снижение поведения ухаживания по отношению к невосприимчивым женщинам на срок до 9 дней 8 . Это естественное поведение может быть использовано для выяснения механизмов обучения, краткосрочной памяти (STM) и долговременной памяти (LTM) 8 , 9 , 12 . Обучение определяется как немедленное снижение поведения ухаживания, которое происходит в течение периода обучения, и часто упоминается как память немедленного восстановления, измеренная через 0-30 мин после контакта с женщиной 6 , 8 . STM измеряется между 30 и 1 часами после тренировки, а LTM чаще всего измеряется через 24 часа после тренировки 8 ( рисунок 1B ). STM может быть вызван с использованием 1-часового периода обучения, но он длится только 2-3 часаS = "xref"> 6 , 8 . В большинстве обучающих парадигм, LTM может быть вызван только разнесенными приступами повторного обучения. Mcbride et al . (1999) 8 показали, что трех интервальных тренингов продолжительностью 1 час было достаточно, чтобы вызвать ухаживание, продолжающееся до 9 дней, в отличие от 2-3 часов, вызванных одной тренировкой в течение 1 часа. McBride et al . 8 также продемонстрировал, что в одном 5-часовом учебном сеансе был получен аналогичный ответ LTM на срок до 9 дней. Мухи не судят постоянно в течение этого 5-часового периода, фактически производя свое собственное разнесенное обучение, чтобы побудить ЛТМ на одной тренировке. Это очень важно с практической точки зрения, значительно увеличивая легкость, с которой этот анализ может быть использован для исследования LTM. Существующие протоколы преимущественно используют единую тренировочную сессию 7 часов для LTM 11 , 12 . В нескольких исследованияхМутантные условия, которые имеют определенные недостатки в разных аспектах обучения ухаживанию. Например, абсорбция тела грибов влияет на STM и LTM, но не на обучение 8 . Мутации в амнезиакном гене, который впервые был определен как специфический регулятор памяти с использованием обонятельного кондиционирования 3 , влияют на STM, но не на обучение 6 . Нарушение регулятора трансляции orb2 (oo18 РНК-связывание (orb) подсемейства CPEB2) и сигнализация ecdysone исключительно влияют на LTM 9 , 13 . Таким образом, обустройство ухаживания является полезной парадигмой для анализа механизмов, лежащих в основе различных этапов обучения и памяти.
Эта работа демонстрирует оптимизированную экспериментальную установку, которая позволяет относительно высокопроизводительное тестирование кондиционирования ухаживания. Кроме того, он описывает сценарий статистического анализа и обсуждает критические факторы анализа. Это shЧто ген Drosophila Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase ( Dhap-at ) Требуется для нейронов для LTM, но не для STM. Человеческий ортолог этого гена, глицерофосфатная O-ацилтрансфераза ( GNPAT ), мутируется в ризомелиновой хондродисплазии punctata типа 2 14 , аутосомно-рецессивное расстройство, характеризующееся тяжелой умственной недееспособностью, судорогами и рядом других клинических характеристик 15 . В этом контексте обустройство ухаживания может быть использовано для функциональной проверки роли генов человеческой болезни в обучении и памяти, что является основой для механистических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ кондиционирования ухаживания является классической парадигмой для анализа обучения и памяти в Drosophila . Представленный здесь протокол следует общей методологии, описанной ранее 6 , 7 , 8 , 9, но включает в себя уникальные аспекты, такие как практические рекомендации, специализированное оборудование и сценарий анализа данных 9 , 12 для тестов рандомизации. Используя этот протокол, можно анализировать большое количество мух параллельно с использованием 96-луночных плоских блоков ( рис. 2А ) для сбора и обучения самцов. Блоки запечатываются ПЦР-клейкой пленкой, благодаря чему мухи легко доступны по мере необходимости. Кроме того, уникальные ухаживающие камеры, описанные здесь, допускают одновременное сопряжение 18 пар мужчина-женщина в почти двумерном пространстве, что iОптимальный для видеоанализа. Специально разработанные ухаживающие камеры просты в использовании, и предусмотрен план здания ( файл S1 , рисунок 2D ). Этот протокол, начиная с создания культур, используемых для сбора испытуемых на получение видеоданных, занимает приблизительно 20 дней ( таблица 1 ). Для анализа видеоданных требуется дополнительное время. По нашему опыту, анализ STM является чрезвычайно надежным. Анализ LTM также довольно устойчив, но он более чувствителен к смешиванию переменных окружения и поэтому может быть сложнее освоить.
Поведение животных может быть довольно переменным. Поэтому критические шаги в протоколе должны выполняться с осторожностью, чтобы уменьшить эту дисперсию. Во-первых, нежное использование аспиратора ( рис. 2B ) уменьшит напряжение, которое может быть наложено грубой обработкой или слишком сильно выдувается. Предлагаемый способ передачи отдельныхВылетает из аспиратора, используя отрицательную геотаксис. Поскольку мухи склонны подниматься, можно просто указать кончик аспиратора; Как раз перед тем, как муха достигнет кончика, нежного удара достаточно, чтобы вылететь. Кроме того, чтобы позволить мужчинам в кабины ухаживания перед тестированием, удар часто не нужен.
Другим важным шагом является сбор и генерация мужских испытуемых. Все мужчины должны собираться, когда они очень молоды и социально наивны. Это может быть достигнуто путем частых сборов во время пиковых периодов экклюзии (шаг 5.2). Если самцы не собираются в этот ограниченный промежуток времени, они могут иметь ранние социальные взаимодействия, что может привести к плохому обучению или высокой вариативности в КИ. Другим фактором мужских испытуемых, которые должны быть оценены, является генетический фон. Различные генетические основы будут демонстрировать различные уровни наивного ухаживания и могут также отличаться в общей активности или локомоторной способности. Когда compaКольцу несколько генотипов, следует соблюдать осторожность в отношении генетического фона, чтобы избежать этих смешающих факторов, которые могут повлиять на оценки LI. Кроме того, следует тщательно оценивать распределение данных CI. Данные CI могут быть как параметрическими, так и непараметрическими, в зависимости от генотипа или других факторов окружающей среды. В некоторых случаях, если распределение CI резко искажается от нормального распределения, может быть лучше использовать медианный CI, а не среднее значение для вычисления LI. Однако, по нашему опыту, использование среднего или среднего CI не влияет на статистическую интерпретацию данных, а использование среднего CI является распространенной практикой в литературе.
Для успешного лечения ухаживания активное участие в отборе мужских попыток ухаживания у самок для женщин является решающим в течение периода обучения. Важно обеспечить, чтобы домашние женщины, используемые в этом анализе, эффективно спаривались иТаким образом, не позволяя совокупление. Это предположение устанавливается в спаренных сосудах, приготовленных на стадии 4, где мухи самцов и самцов помещаются вместе в течение 4 дней ( таблица 1 ). Впоследствии спаривание может контролироваться путем регулярного обследования тестовых видеороликов и наблюдения пар мужского и женского пола во время обучения. Если спаривание действительно происходит, есть несколько мер, которые могут быть приняты при подготовке вышедших женщин. Во-первых, беременные женщины должны выращиваться в оптимальных условиях размножения. Флаконы могут быть дополнены дрожжевой пастой и сложенной фильтровальной бумагой для увеличения потенциальных поверхностей сопряжения. Инкубация мух в условиях, описанных здесь, в прошлом производила надежных самок, но это может различаться в разных лабораториях и с использованием разных генетических штаммов. Следовательно, может потребоваться оптимизация генерации вышедших самок путем изменения времени и условий инкубации.
Количественная оценка поведения ухаживания являетсяЕще один важный шаг в этом протоколе. Это можно сделать вручную или автоматически с помощью специализированных программ 9 . Автоматическая количественная оценка является быстрой и, в принципе, беспристрастной. Было опубликовано несколько программ 21 , 22 , 23 ; Однако они не просто используются, часто требуются специализированные видеоформаты и передовые вычислительные навыки. Ручная количественная оценка проста и точная, но она очень трудоемка и зависит от индивидуальной изменчивости и предвзятости. Важно подчеркнуть, что в этом протоколе не рассматриваются требования к форматированию видео, которые потенциально необходимы для автоматизированной количественной оценки ИИ. Для ручной количественной оценки используйте любое простое устройство записи видео, которое имеет потенциал для создания видео достаточного качества, чтобы точно наблюдать поведение ухаживания. Для автоматизированной количественной оценки, вероятно, будут разныеВ зависимости от используемого программного обеспечения, и пользователи должны тщательно изучить это, если требуется автоматическая количественная оценка.
В сочетании с обширными инструментами, которые доступны для генетической манипуляции мухами, анализ кондиционирования ухаживания обеспечивает надежное считывание, которое может быть использовано для анализа молекулярных механизмов и нейронных сетей, участвующих в обучении и памяти.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем Венский ресурсный центр дрозофилы для обеспечения штаммов дрозофилы . Кроме того, в этом исследовании использовались запасы, полученные в Центре акций Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537). Это исследование частично поддерживалось крупномасштабной интегрированной сетью FUC7 Европейского союза Gencodys для KK, HvB и AS, а также грантами проекта NSERC Discovery и CIHR для JMK
Materials
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | – | – | Any sharp will do |
| Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | – | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – | ||
| Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | – | |
| Corn flour | de Molen | – | |
| Sugar | de Molen | – | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – |
References
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
