תסיסנית חיזור התניה כמדד למידה וזיכרון
Summary
פרוטוקול זה מתאר לימוד תסיסנית זיכרון assay שנקרא מיזוג חיזור. זה assay קלאסי מבוסס על צמצום התנהגות החיזור הגברי לאחר דחייה מינית על ידי נקבה לא נקלט מראש. צורה טבעית זו של גמישות התנהגותית יכולה לשמש לבחינת למידה, זיכרון לטווח קצר וזיכרון לטווח ארוך.
Abstract
תובנות רבות על המנגנונים המולקולריים שבבסיס הלמידה והזיכרון הובאו לידי ביטוי באמצעות מבחני התנהגות פשוטים באורגניזמים דוגמת זבוב הפירות, תסיסנית מלנוגאסטר . תסיסנית שימושית להבנת הנוירוביולוגיה הבסיסית העומדת בבסיס הגירעונות הקוגניטיביים הנובעים ממוטציות בגנים הקשורים בהפרעות קוגניטיביות אנושיות, כגון נכות אינטלקטואלית (ID) ואוטיזם. עבודה זו מתארת מתודולוגיה לבדיקת למידה וזיכרון באמצעות פרדיגמה קלאסית ב תסיסנית המכונה מיזוג חיזור. זכר טס לנקבות המשפט באמצעות דפוס ברור של התנהגויות בקלות לזהות. נקבות מוקדמות אינן קשורות להזדווגות, והן ידחו את ניסיונות ההזדווגות של הזכר. בתגובה לדחייה זו, זבובים זכרים מצמצמים את התנהגות החיזור שלהם. הפחתה מלמדת זו של התנהגות החיזור נמדדת עם הזמן, ומשמשת אינדיקציה ללמידה ולזיכרון. הבסיסי numeפלט Rical של assay זה הוא מדד החיזור (CI), אשר מוגדר כאחוז הזמן שגבר מבלה חיזור במהלך 10 דקות מרווח. מדד הלמידה (LI) הוא ההפחתה היחסית של CI בזבובים שנחשפו לנשיקה מוקדמת בהשוואה לזבובים נאיביים ללא מפגשים חברתיים קודמים. עבור השוואה סטטיסטית של LIs בין גנוטיפים, מבחן אקראי עם bootstrapping משמש. כדי להמחיש כיצד assay ניתן להשתמש כדי לטפל בתפקיד של הגן הנוגע למידה וזיכרון, נוקדון פאן עצבי של dyydroxyacetone פוספט acyltransferase ( Dhap-at ) היה מאופיין כאן. אורתולוג האדם של Dhap-at , glyceronephosphate O-acyltransferase ( GNPT ), מעורב ב- chondrodysplasia punctata type 2, תסמונת אוטוזומלית-רצסיבית המאופיינת במזהה חמור. באמצעות assay מיזוג חיזור, נקבע כי Dhap-at נדרש זיכרון לטווח ארוך, אבל לא עבורזיכרון לטווח קצר. תוצאה זו משמשת כבסיס לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים הבסיסיים.
Introduction
המנגנונים המולקולריים שבבסיס הלמידה והזיכרון נשמרים בכל מיני מינים. חלוצי העבודה הקרנת תסיסנית melanogaster שורות מוטציה עבור פגמים הלמידה חוש הריח והזיכרון סיפקה מפתח תובנות מולקולריות לתוך התהליכים הבסיסית למידה וזיכרון 1 . מחקרים אלה זיהו חלק מהגנים הראשונים המעורבים בלמידה ובזיכרון, כגון rutabaga 2 , amnesiac 3 ו- dunce 4 , והם חושפים תפקיד קריטי עבור איתות מעגלי אדנוזין מונופוספט (cAMP) 5 .
מסכים גנטיים מוקדמים עבור מוטציות זיכרון נערכו בעיקר באמצעות מיזוג הריח. עם זאת, כמה שיטות למדוד צורות אחרות של למידה וזיכרון צמחו לאורך זמן. אחד הפרדיגמות למידה וזיכרון הנפוץ ביותר, ואת assay המתואר כאן, ידוע כ cהתאימות הראשונה, שתוארה לראשונה על ידי סיגל והול 6 וצורפה מאוחר יותר על ידי כמה קבוצות מחקר אחרות 7 , 8 , 9 . התנייה של החייבות תלויה בנוכחות של פרומון ספציפי, cis- acenate (cVA), על הבטן הנשית, אשר מופקד על ידי הזכר במהלך הזדווגות. חישה cVA על הבטן הנשית באופן טבעי מפחית התנהגות החיזור, וכאשר מצמידים עם מעשה של דחייה על ידי הנקבה, את ההשפעה של cVA על הפחתת החיזור הגברי הוא משופר באופן דרמטי. התגובה של זבובים זכרים assay זה ניתן לכמת בקלות על ידי התבוננות התנהגות החיזור שלהם, המאופיינת על ידי התמצאות לקראת ואחרי הנקבה, הקשה, הארכת ורטט את הכנף, ללקק, ולנסות copulation 10 ( איור 1 א ). זבובים זכר ללמוד distuisuis שעה בין דחייה מינית לבין נשים שאינן קשורות לרווחה, ואחרי דחייה מינית, הן מציגות התנהגות חיזור מופחתת כלפי נקבות שאינן קולטות עד 9 ימים 8 . זו התנהגות טבעית ניתן להשתמש כדי להבהיר את המנגנונים הבסיסית למידה, זיכרון לטווח קצר (STM), וזיכרון לטווח ארוך (LTM) 8 , 9 , 12 . הלמידה מוגדרת כהפחתה מיידית בהתנהגות החיזור המתרחשת במהלך תקופת האימון, והיא מכונה לעתים קרובות זיכרון זיכרון מיידי, שנמדד 0 – 30 דקות לאחר החשיפה לנקבה 6 , 8 . STM נמדד בין 30 דקות ו 1 שעה לאחר אימון, בעוד LTM נמדדת לרוב 24 שעות לאחר אימון 8 ( איור 1 ב ). STM יכול להיות המושרה באמצעות תקופת אימון 1-h, אבל זה נמשך רק 2-3 שעותS = "xref"> 6 , 8 . ברוב פרדיגמות הלמידה, LTM יכול להיגרם רק על ידי התקפות שונות של אימון חוזר. מקברייד ואחרים . (1999) 8 הראו כי שלושה מפגשים, 1 שעות אימון פגישות היו מספיק כדי לעורר זיכרונות זיכרון שנמשך עד 9 ימים, בניגוד 2-3 שעות המושרה על ידי אימון אימון 1 שעה. מקברייד ואחרים . 8 הוכיחו גם כי אימון יחיד 5 שעות אימון הפיק תגובה דומה LTM עד 9 ימים. זבובים לא בית המשפט כל הזמן במהלך תקופה זו 5 שעות, למעשה לייצר אימון שלהם מרווחים כדי לעורר LTM בפגישה אימון אחד. זה חשוב מאוד מנקודת מבט מעשית, להגדיל במידה ניכרת את הקלות שבה assay זה יכול לשמש כדי לחקור LTM. פרוטוקולים הנוכחי בעיקר להשתמש בפגישה אימון יחיד של 7 שעות עבור LTM 11 , 12 . מספר מחקרים חקרו אחרתתנאי מוטציה שיש להם פגמים ספציפיים בהיבטים שונים של למידה חיזור. לדוגמה, אבלציה בגוף פטריות משפיעה על STM ו- LTM, אך לא לומדת 8 . מוטציות בגן אמנזיה, אשר הוגדר לראשונה כווסת מסוים של זיכרון באמצעות מיזוג הריח 3 , להשפיע STM אבל לא לומד 6 . הפרעה של הרגולטור תרגום orb2 (oo18 RNA מחייב (גלגל) CPEB2 subfamily) ו ecdysone איתות בלעדי השפעה LTM 9 , 13 . לפיכך, מיזוג חיזור הוא פרדיגמה שימושית לנתח את המנגנונים העומדים מאחורי השלבים השונים של הלמידה והזיכרון.
עבודה זו מדגימה הגדרה ניסיונית מותאמת המאפשרת את התפוקה גבוהה יחסית של התניה חיזור. יתר על כן, הוא מתאר סקריפט ניתוח סטטיסטי דן על גורמים קריטיים של assay. זה שמשלו כאן כי הגן תסיסנית Dihydroxyacetone acyltransferase פוספט ( Dhap-at ) נדרש נוירונים עבור LTM, אבל לא עבור STM. אורתולוג האדם של הגן הזה, גליצרונפוספט O-acyltransferase ( GNPAT ), הוא מוטציה ב- chondrodysplasia punctata type 2 14 , הפרעה אוטוסומלית-רצסיבית המאופיינת על ידי נכות אינטלקטואלית חמורה, התקפים ועוד מספר מאפיינים קליניים. בהקשר זה, ניתן להשתמש בהתניה של חיזור כדי לאמת באופן פונקציונלי את תפקידם של גנים של מחלות אנושיות בלמידה ובזיכרון, המהווים בסיס למחקרים מכניסטיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיזור מיזוג החיזור הוא פרדיגמה קלאסית לניתוח של למידה וזיכרון תסיסנית . הפרוטוקול המוצג כאן כדלקמן המתודולוגיה הכללית שתוארה בעבר 6 , 7 , 8 , 9 אבל כולל היבטים ייחודיים כגון הנחיות מעשיות, ציוד מיוחד, ניתוח סקריפט נתונים 9 , 12 עבור בדיקות אקראיות. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לנתח מספרים גדולים של זבובים במקביל באמצעות 96-גם שטוחים בתחתית בלוקים ( איור 2 א ) לאסוף ולאמן זכרים. בלוקים הם אטומים עם סרט PCR דבק, מה שהופך את הזבובים נגיש בקלות בעת הצורך. בנוסף, חדרי החיזור הייחודיים המתוארים כאן מאפשרים זיווג סימולטני של 18 זוגות זכר לנקבה בחלל דו-מימדי כמעט שאניS אופטימלי לניתוח וידאו. החדרים מותאמים אישית חיזור קל לשימוש, תוכנית הבנייה מסופק ( קובץ S1 , איור 2 ד ). פרוטוקול זה, מן הקמת תרבויות המשמש לאסוף נושאים הבדיקה לרכישת נתוני וידאו, לוקח בערך 20 ימים ( טבלה 1 ). נדרש זמן נוסף לניתוח נתוני וידאו. מניסיוננו, אסאי STM הוא חזק מאוד. Assay LTM הוא גם חזק למדי, אבל זה יותר רגיש משתנים סביבתיים confounding ולכן יכול להיות קשה יותר לשלוט.
התנהגות בעלי חיים יכולה להיות משתנה למדי. לכן, צעדים קריטיים בפרוטוקול חייב להיעשות בזהירות כדי לצמצם את השונות. ראשית, שימוש עדין של aspirator ( איור 2 ב ) יפחית את הלחץ כי ניתן להטיל על ידי טיפול מחוספס או על ידי נושבת החוצה חזק מדי. שיטה מוצעת להעברת הפרטזבובים מתוך aspirator היא באמצעות geotaxis שלילי. כמו זבובים נוטים ללכת למעלה, אפשר פשוט להצביע על קצה של aspirator למעלה; בדיוק לפני שהטוס מגיע לקצה, מכה עדינה מספיקה כדי לאפשר לזבוב לצאת החוצה. בנוסף, כדי לתת לזכרים לתאי החיזור לפני הבדיקה, מכה לעתים קרובות לא הכרחי.
צעד חשוב נוסף הוא האוסף והדיור של נושאי המבחן הגברי. יש לאסוף את כל הגברים כאשר הם צעירים מאוד ונאיביים חברתית. זה יכול להיות מושגת על ידי איסוף תכופים בתקופות השיא של eclosion (שלב 5.2). אם גברים אינם נאספים בפרק זמן קצר זה, הם יכולים להיות אינטראקציות חברתיות מוקדמות, אשר עלול לגרום למידה לקויה או השתנות גבוהה ב- CI. גורם נוסף של נבדקי הניסוי הגברי שיש להעריך הוא הרקע הגנטי. רקע גנטי שונה יציג רמות שונות של חיזור נאיבי ויכול גם להיות שונה בפעילות הכללית או ביכולת התנועה. כאשר compaריבוי גנוטיפים, יש להקפיד על הרקע הגנטי כדי למנוע את הגורמים המבלבלים שעלולים להשפיע על ציוני LI. בנוסף, יש לנתח בקפידה את התפלגות נתוני ה- CI. נתוני CI יכולים להיות פרמטריים ולא פרמטריים, בהתאם לגנוטיפ או לגורמים סביבתיים אחרים. במקרים מסוימים, אם ההתפלגות של CI מופחתת באופן דרמטי מהתפלגות נורמלית, עדיף להשתמש בחציון CI במקום בממוצע לחישוב LI. עם זאת, מניסיוננו, השימוש ב- CI החציוני או הממוצע אינו משפיע על הפרשנות הסטטיסטית של הנתונים, והשימוש ב- CI הממוצע הוא הנוהג המקובל בספרות.
עבור החיזור מוצלח החיזור, הדחייה הפעילה של ניסיונות חיזור הגבר על ידי הנקבות שנקבע הוא חיוני במהלך תקופת האימון. חשוב לוודא כי נקבות שהשתמשו בעבר assay זה כבר הזדווגות ביעילות והםובכך לא מאפשר הזדווגות. זה preating הוא הקים את צלוחיות הזדווגות שהוכנו בשלב 4, שבו הזכרים והנקבות טסים שוכנים יחד במשך 4 ימים ( טבלה 1 ). לאחר מכן, ההזדווגות ניתן לפקח על ידי בדיקה סדירה של בדיקות קטעי וידאו על ידי התבוננות זוגות זכר ונקבה במהלך האימון. אם ההזדווגות מתרחשת, ישנם מספר צעדים שניתן לנקוט במהלך הכנת נקבות מוקדמות. ראשית, נקבות נקבות צריך להיות reared בתנאים הרבייה אופטימלית. בקבוקונים ניתן להשלים עם שמרים להדביק נייר מקופל מסנן להגדיל משטחי ההזדווגות הפוטנציאליים. הדגירה של זבובים בתנאים המתוארים כאן יצרה בעבר נקבות חזקות ומוצקות, אך זה עשוי להשתנות במעבדות שונות ובשימוש בזנים גנטיים שונים. לכן, ייתכן שיהיה צורך לייעל את הדור של נקבות על ידי שינוי זמן הדגירה ותנאי.
כימות התנהגות החיזור היאצעד קריטי נוסף בפרוטוקול זה. זה יכול להיעשות באופן ידני או אוטומטי באמצעות תוכנות מיוחדות 9 . כימות אוטומטי הוא מהיר, באופן עקרוני, משוחדת. מספר תוכניות פורסמו 21 , 22 , 23 ; עם זאת, הם אינם פשוט לשימוש, לעתים קרובות הדורשים פורמטים של וידאו מיוחדים ומיומנויות חישוב מתקדמות. כימות ידני הוא קל ומדויק, אבל זה מאוד עבודה אינטנסיבית כפוף השתנות הפרט הטיה. חשוב להדגיש כי פרוטוקול זה אינו עונה על הדרישות של עיצוב וידאו, כי הם נדרשים פוטנציאליים עבור כימות אוטומטי של CIs. עבור כימות ידני, להשתמש בכל מכשיר הקלטה פשוטה וידאו שיש לו את הפוטנציאל לייצר וידאו באיכות מספקת כדי לצפות במדויק התנהגות החיזור. עבור כימות אוטומטי, סביר להניח שיהיה שונהדרישות בהתאם לתוכנה בשימוש, והמשתמשים צריכים לחקור את זה ביסודיות אם כימות אוטומטי הוא הרצוי.
בשילוב עם הכלים הנרחבים הזמינים עבור המניפולציה הגנטית של זבובים, assay מיזוג החיזור מספק readout חזקים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח מנגנונים מולקולריים רשתות עצביות המעורבים למידה וזיכרון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים את וינה תסיסנית משאבים מרכז למתן זנים תסיסנית . בנוסף, מניות שהתקבלו מ Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) שימשו במחקר זה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי האיחוד האירופי FP7 בקנה מידה גדול רשת משולבת Gencodys ל KK, HvB, AS ו על ידי NSERC Discovery ו CIHR פרויקט מענקי JMK
Materials
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | – | – | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | – | – | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | – | – | Any sharp will do |
| Needle | – | – | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | – | – | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | – | – | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | – | camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | – | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – | ||
| Yeast paste | – | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | – | |
| Corn flour | de Molen | – | |
| Sugar | de Molen | – | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | – |
References
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71, 708-712 (1974).
- Livingstone, M. S., Sziber, P. P., Quinn, W. G. Loss of calcium/calmodulin responsiveness in adenylate cyclase of rutabaga, a Drosophila learning mutant. Cell. 37, 205-215 (1984).
- Quinn, W. G., Sziber, P. P., Booker, R. The Drosophila memory mutant amnesiac. Nature. 277, 212-214 (1979).
- Dudai, Y., Jan, Y. N., Byers, D., Quinn, W. G., Benzer, S. dunce, a mutant of Drosophila deficient in learning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73, 1684-1688 (1976).
- Dubnau, J., Tully, T. Gene discovery in Drosophila: new insights for learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 21, 407-444 (1998).
- Siegel, R. W., Hall, J. C. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 3430-3434 (1979).
- Kamyshev, N. G., Iliadi, K. G., Bragina, J. V. Drosophila conditioned courtship: two ways of testing memory. Learning & memory. 6, 1-20 (1999).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nature Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Hall, J. C. The mating of a fly. Science. 264, 1702-1714 (1994).
- Keleman, K., et al. Dopamine neurons modulate pheromone responses in Drosophila courtship learning. Nature. 489, 145-149 (2012).
- Kramer, J. M., et al. Epigenetic regulation of learning and memory by Drosophila EHMT/G9a. PLoS Biol. 9. 9, e1000569 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6381-6386 (2009).
- Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am. J. Hum. Genet. 98, 149-164 (2016).
- Buchert, R., et al. A peroxisomal disorder of severe intellectual disability, epilepsy, and cataracts due to fatty acyl-CoA reductase 1 deficiency. Am. J. Hum. Genet. 95, 602-610 (2014).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. JoVE. , (2017).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2016).
- Stepien, B. K., et al. RNA-binding profiles of Drosophila CPEB proteins Orb and Orb2). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, E7030-E7038 (2016).
- Basu, D. Randomization Analysis of Experimental Data: The Fisher Randomization Test. J Am Stat Assoc. 75, 575-582 (1980).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6, 297-303 (2009).
- Reza, M. A., et al. Automated analysis of courtship suppression learning and memory in Drosophila melanogaster. Fly. 7, 105-111 (2013).
- Schneider, J., Levine, J. D. Automated identification of social interaction criteria in Drosophila melanogaster. Biol. Lett. 10, 20140749 (2014).
