Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

O fluido da mucosa do nariz torna-se a parte líquida do sistema superior-das vias respiratórias. Consiste de uma matriz complexa de mediadores derivado a interação entre o epitélio e as células imunitárias que compõem a primeira linha de defesa contra a invasão de microorganismos. A mucosa nasal é facilmente acessível, e há uma forte relação funcional e imunológica entre o nariz e os brônquios¹. Este compartimento é de especial interesse em relação às doenças das vias respiratórias que são comuns na infância, como asma e rinite alérgica, mas também a uma gama de outras doenças respiratórias mais prevalentes mais tarde na vida.

Aqui, descrevemos a implementação de um método para amostra intacta da mucosa revestimento fluido da cavidade nasal usando uma técnica não-invasiva, baseada em papel de filtro, bem como um procedimento de extração subsequente, usada para eluir analitos baseados em proteína dos papéis de filtro antes da sua quantificação. Esta técnica por exemplo, pode ser usada para obter na vivo assinaturas imunes de indivíduos saudáveis e indivíduos com várias doenças respiratórias. Além disso, é possível examinar as exposições de importância para uma assinatura específica imune e avaliar se é um preditor ou mediador do desenvolvimento posterior da doença.

Fluido de mucosa anteriormente tiver sido obtido por lavagem nasal², que muitas vezes é precedida por um teste de desafio nasal, onde um alérgeno é introduzido em níveis elevados para estimular uma resposta inflamatória^3,4. No entanto, a técnica de lavagem nasal não é viável em crianças pequenas e introduz um factor de diluição desconhecido, que confunde os resultados, como o mediador diluído níveis podem cair abaixo do limite de detecção do ensaio⁵. Além disso, devido ao fator de diluição desconhecido, as analito medida respostas dos testes desafio nasal não são comparáveis entre indivíduos, limitando assim a utilidade da técnica de lavagem nasal em uma coorte de configuração. Finalmente, desafio de alérgeno só é aplicável em indivíduos sensibilizados e outros desafios, como o desafio de histamina, não são fisiologicamente relevantes, potencialmente causando um efeito de teto na liberação de mediador. Estes problemas são contornados na técnica apresentada em papel de filtro para recolha de fluidos de mucosa, onde a individual secreção de fluidos e níveis de analito são apenas fatores que influenciam a variação inter-individual.

Durante o procedimento de extração, analitos são eluídos dos papéis de filtro após a adição de volumes idênticos de buffer para todas as amostras. Isso favorece semelhante ex vivo diluição das amostras. Uma solução tampão de solução salina isotônica baseada em albumina é usado para a etapa de extração; permite a extração de mediadores à base de proteínas e estabiliza as proteínas para limitar a desnaturação durante o congelamento subsequente de proteínas eluted antes da quantificação. Para evitar a degradação proteica durante a fase de extração, um coquetel de inibidores de protease é adicionado para o buffer de extração.

A implementação de técnicas que permitem a quantificação do intacta, na vivo-mediadores imunes gerados em locais da mucosa é de extrema importância. Primeiro, o site da mucosa torna-se o maior órgão imunológico no corpo. Em segundo lugar, a localização nasal é o principal local de exposição no ar e está firmemente conectada ao compartimento imunológicas respiratórias dos pulmões¹. Em terceiro lugar, a possibilidade de levantamento deste órgão importante com uma técnica não-invasiva abre a possibilidade de fornecer uma infinidade de informações sobre o eixo importante interação micróbio imune em relação à saúde e doença nas vias aéreas. Em quarto lugar, existem muitas outras possíveis aplicações desta técnica, tais como estudar alterações imunológicas locais em experimentações randomized, controladas de drogas e micronutrientes.

Inicialmente implementamos a técnica nos estudos prospectivos Copenhague sobre asma em coorte de₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) de infância, onde determinamos o perfil imunológico do fluido em crianças de 7 anos de idade com rinite alérgica versus controles saudáveis¹³mucosa. Posteriormente, com êxito aplicamos esta técnica à coorte longitudinal de₂₀₁₀ COPSAC e imune perfis das vias respiratórias avaliados em 1 mês, 2 anos e 6 anos de idade e em instâncias de sintomas respiratórios agudos. Resultados de neonatos a 1 mês de idade demonstraram importantes associações entre a assinatura imune e a exposição ambiental do início da vida^{7,8,9,10,11,12}.