Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore
Summary
Questo protocollo descrive una tecnica non invasiva per il campionamento del liquido di rivestimento mucoso indisturbati dalle vie respiratorie superiori. Può essere utilizzato per eseguire la quantificazione dei livelli in vivo dei mediatori di proteina, quali citochine e chemochine, in soggetti di tutte le età.
Abstract
Questo protocollo descrive campionamento non invadente di liquido di rivestimento mucoso delle vie respiratorie superiore indisturbato. E ‘ anche in dettaglio la procedura di estrazione utilizzata prima dell’analisi di mediatori immuni in eluati fluidi per lo studio della firma immuni topica delle vie aeree, senza la necessità di procedure di stimolazione (spesso utilizzato da altre tecniche). Il liquido di rivestimento mucoso viene campionato su una striscia di carta da filtro posizionato sulla parte anteriore del inferior turbinate e sinistro per 2 min di assorbimento. Analiti vengono eluiti dalla carta da filtro, e gli eluati di base di proteine estratti vengono analizzati da un immunoassay elettrochemiluminescenza-based, che consente per la quantificazione di alto-sensibilità di analiti a basso e alto livello nello stesso campione. Abbiamo misurato i livelli in vivo di 20 mediatori immuni preselezionati legate alla specifica immunitario vie nella mucosa delle vie respiratorie superiore di segnalazione, ma la tecnica non è limitata a quel pannello specifico o il sito di campionamento. La tecnica innanzitutto è stata implementata nei bambini di 7-year-old da studi prospettivi Copenaghen sull’asma nella coorte di2000 (COPSAC2000) di infanzia con rinite allergica. Da allora in poi è stato usato nella coorte di nascita2010 COPSAC longitudinale, provata a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Abbiamo correttamente acquisiti e analizzati campioni da 620 (89%) di 700 1-mese-vecchi bambini; alcuni campioni erano sotto il limite di rilevamento del test (segnalato come la mediana (Inter-Quartile Range (IQR)). Il numero di campioni di sotto del limite di rilevazione (cioè da 0 al set point per il limite inferiore di rilevamento) per ogni Mediatore era 29 (7,25-119.5). Questa tecnica consente la quantificazione del profilo di in vivo delle vie respiratorie mucose immuni dalla nascita, può essere applicata longitudinalmente e può essere applicata agli studi sull’effetto di genetica e le esposizioni ambientali di presto-vita, patofisiologia, endotyping e il monitoraggio di malattie respiratorie, sviluppo e valutazione di nuove terapie.
Introduction
Il liquido di rivestimento mucoso del naso costituisce la parte liquida del sistema della superiore-via aerea. Si compone di una matrice complessa di mediatori derivati dall’interazione tra l’epitelio e cellule immunitarie che compongono la prima linea di difesa contro l’invasione di microrganismi. La mucosa nasale è facilmente accessibile, e c’è una forte relazione funzionale ed immunologica tra il naso e bronchi1. Questo comparto è di particolare interesse in relazione a malattie delle vie respiratorie che sono comuni nell’infanzia, come l’asma e la rinite allergica, ma anche a una serie di altri disturbi respiratori più prevalente più tardi nella vita.
Qui, descriviamo l’implementazione di un metodo a campione indisturbato mucoso rivestimento liquido dalla cavità nasale usando una tecnica non invasiva basata su carta da filtro, così come una procedura di estrazione successiva, utilizzato per eluire basati su proteine analiti dalla carta da filtro prima della loro quantificazione. Questa tecnica, ad esempio, consente di ottenere in vivo immuni firme di individui sani e di individui con le varie malattie respiratorie. Inoltre, è possibile esaminare le esposizioni di importanza per una firma immune specifica e valutare se è un preannunciatore o mediatore di sviluppo successivo di malattia.
Liquido di rivestimento mucoso è stata ottenuta in precedenza da lavaggio nasale2, che è spesso preceduto da una prova nasale di sfida, dove un allergene è stato introdotto in alti livelli di stimolare una risposta infiammatoria3,4. Tuttavia, la tecnica di lavaggio nasale non è fattibile nei bambini piccoli e introduce un fattore di diluizione sconosciuto, che confonde gli esiti, come mediatore diluito livelli possono scendere sotto il limite di rilevamento del test5. Inoltre, a causa del fattore di diluizione sconosciuto, le risposte di analita misurato dal test di provocazione nasale non sono comparabili tra individui, limitando così l’utilità della tecnica del lavaggio nasale in una coorte di impostazione. Infine, la sfida dell’allergene è applicabile solo in soggetti sensibilizzati, e altre sfide, come la sfida di istamina, non sono fisiologicamente rilevanti, potenzialmente causando un effetto soffitto sul rilascio del Mediatore. Questi problemi vengono eluse la tecnica basata su carta da filtro presentato per accumulazione fluida rivestimento mucoso, dove i singola secrezione di fluidi e i suoi livelli analitici sono gli unici fattori che influenzano la varianza inter-individuale.
Durante la procedura di estrazione, analiti vengono eluiti dai giornali filtro dopo l’aggiunta di volumi identici del buffer per tutti i campioni. Questo favorisce la diluizione simile ex vivo di tutti i campioni. Un tampone di estrazione di soluzione salina isotonica basata su albumina viene utilizzata per la fase di estrazione; consente l’estrazione dei mediatori a base di proteine e stabilizza le proteine per limitare la denaturazione durante il successivo congelamento delle proteine eluite prima della quantificazione. Per evitare la degradazione della proteina durante la fase di estrazione, viene aggiunto un cocktail di inibitori della proteasi per il tampone di estrazione.
L’attuazione di tecniche che consentono per la quantificazione del indisturbati, in vivo-generati mediatori immuni alle mucose siti è della massima importanza. In primo luogo, il sito della mucosa costituisce il più grande organo immunologico nel corpo. In secondo luogo, la posizione nasale è il sito primario di esposizione dispersa nell’aria ed è strettamente collegata al vano respiratorie immunologico del polmoni1. In terzo luogo, la possibilità di rilievo di questo importante organo con una tecnica non invasiva apre la possibilità di fornire una pletora di informazioni sull’asse di interazione di microbo-immunitario importante in materia di salute e malattia delle vie aeree. In quarto luogo, ci sono molte altre possibili applicazioni di questa tecnica, come studiare le alterazioni immunologiche locali in randomizzato, studi controllati di farmaci e micronutrienti.
Inizialmente abbiamo implementato la tecnica in studi prospettivi Copenaghen sull’asma nella coorte di infanzia2000 (COPSAC2000), dove abbiamo determinato il profilo immunitario del rivestimento mucoso fluido nel 7-anno-vecchi bambini con rinite allergica rispetto a controlli sani13. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica al gruppo di2010 COPSAC longitudinale e profili immuni valutati delle vie respiratorie a 1 mese, 2 anni e 6 anni di età e alle istanze di sintomi respiratori acuti. Risultati dai neonati 1-mese-vecchio hanno dimostrato importanti associazioni tra la firma immune e l’esposizione ambientale di presto-vita7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con la tecnica presentata qui, siamo stati in grado di determinare l’in vivo della superiore-via aerea mucoso profilo immunitario nei bambini da più presto 1 mese di età, che non è stato fatto in precedenza. Abbiamo osservato che la presenza di batteri specifici delle vie respiratorie e picornavirus7,11, così come altri pre e perinatale esposizioni, sono state rispecchiate nel profilo immunitario delle vie respiratorie dei neonati. Inoltre, abbiamo u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esprimiamo la nostra gratitudine per i bambini e le famiglie dello studio di coorte COPSAC2010 per tutto il loro sostegno e impegno. Riconosciamo e apprezzare gli sforzi unici della squadra di ricerca COPSAC e l’aiuto tecnico da tecnico Lisbeth Buus Rosholm, Technical University of Denmark, per la misurazione di citochine e chemochine.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
