Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres
Summary
Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.
Abstract
Ce manuscrit décrit un moyen d'enrichir les progéniteurs neuronaux de la population de cellules stromales de la moelle (MSC) et ensuite de les diriger vers le sort de la maladie de Schwann mûr. Nous avons soumis les MSC de rat et humains à des conditions hypoxiques transitoires (1% d'oxygène pendant 16 h), suivies d'une expansion sous forme de neurosphères sur un substrat à faible adhérence avec un supplément de facteur de croissance épidémique (EGF) / supplément de fibroblaste basique (bFGF). Les neuro-sphères ont été ensemencées sur du plastique de culture de tissu revêtu de poly-D-lysine / laminine et cultivées dans un cocktail gliogénique contenant la β-Hereguline, le bFGF et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour générer des cellules de type Schwann (SCLC). Les SCLC ont été dirigés vers l'engagement du devenir par coculture pendant 2 semaines avec des neurones de ganglions de racines dorsales purifiés (DRG) obtenus à partir de rats Sprague Dawley enceintes E14-15. Les cellules Schwann d'âge mûr démontrent une persistance dans l'expression de S100β / p75 et peuvent former des segments de myéline. Les cellules générées de cette manière ont un potentielPplications dans la transplantation de cellules autologues après une lésion de la moelle épinière, ainsi que dans la modélisation de la maladie.
Introduction
La transplantation de progéniteurs neuronaux et leurs dérivés se révèle prometteuse en tant que stratégie de traitement suite à une lésion du nerf traumatique 1 , 2 et une neurodégénérescence 3 , 4 . Avant l'application clinique, il est essentiel d'assurer: i) une méthode pour accéder et développer une source autologue de cellules souches / progénitrices et ii) un moyen de les diriger vers des types de cellules adultes pertinents 3 . Notre intérêt pour la thérapie cellulaire pour la lésion de la moelle épinière nous a permis de rechercher une source cellulaire autologue robuste de progéniteurs neuronaux à partir de tissus adultes.
Une sous-population de MSC provient de la crête neurale et est facilement accessible à partir de la cavité de la moelle. Ces cellules sont des progéniteurs neuronaux qui peuvent générer des neurones et de la glie 5 . Les modèles animaux d'ischémie cérébrale démontrent que l'hypoxie favorise le prolapsus L'infiltration et la multiplicité des progéniteurs neurologiques dans le cerveau 6 . Ceci a servi de base à l'utilisation du préconditionnement hypoxique comme moyen d'expansion sur les progéniteurs neurologiques dérivés de la moelle.
La transplantation de cellules de Schwann dans la moelle épinière lésée favorise la régénération 2 . Les SCLC peuvent être générés à partir de MSC au moyen de suppléments avec des facteurs gliogéniques ( p. Ex., Β-Heregulin, bFGF et PDGF-AA) mais démontrent une instabilité phénotypique. Lors du retrait des facteurs de croissance, ils reviennent à un phénotype de type fibroblaste 7 . L'instabilité phénotypique est indésirable dans la transplantation cellulaire en raison du risque de différenciation aberrante et de carcinogenèse. Comme les précurseurs de cellules de Schwann sont associés à des faisceaux d'axones dans le nerf périphérique embryonnaire 8 , nous avons été conduits à des SCLC de coculture avec des neurones DRG embryonnaires purifiés 7 ,Ass = "xref"> 9. Les cellules Schwann matures résultantes sont engagées et démontrent une fonction in vitro 7 , 9 et 10 in vivo .
Notre protocole pour l'enrichissement des progéniteurs neuronaux des MSC est simple et efficace et entraîne une augmentation du nombre de cellules pour les tests ultérieurs. La dérivation des cellules Schwann engagées par le biais de la plate-forme coculture permet l'étude de la différenciation gliale et la génération de cellules Schwann stables et fonctionnelles pour une application clinique potentielle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est essentiel de préserver la «tige» des MSC avant l'enrichissement des progéniteurs neuronaux par un préconditionnement hypoxique et une culture de la neurosphère. De notre expérience, les MSC multipotents peuvent être identifiés de manière fiable par leur morphologie allongée de type fibroblaste. En revanche, les MSC qui ont adopté une morphologie quadrangulaire plus aplatie, avec des fibres de stress cytosquelettiques proéminentes, n'admettent pas facilement le devenir des cellules neurales et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier le Dr Nai-Sum Wong d'avoir fourni l'appareil de chambre hypoxique et Mme Alice Lui pour le soutien technique.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
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