Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen
Summary
Spiercellen (MSC's) met neurale potentieel bestaan in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een middel om te verrijken voor neurale voorliefhebbers van de MSC-populatie en daarna te leiden naar het volwassen Schwann-cellot. Wij ondervonden ratten- en menselijke MSC's voor transiente hypoxische condities (1% zuurstof gedurende 16 uur), gevolgd door uitbreiding als neurospheren bij substratum met een lage bindingstijd, met supplementatie van de epidermale groeifactor (EGF) / basis fibroblastgroeifactor (bFGF). Neurospheren werden gepolijst op poly-D-lysine / laminine-beklede weefselkweekplastic en gekweekt in een gliogene cocktail die β-Heregulin, bFGF en bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) bevat om Schwann-celachtige cellen te genereren (SCLC's). SCLC's werden gedurende 2 weken door middel van cocultuur door middel van cocultuur geregeld met gezuiverde Dorsal root Ganglia (DRG) neuronen verkregen uit E14-15 zwangere Sprague Dawley ratten. Volwassen Schwann cellen tonen aanhoudendheid in S100p / p75 expressie en kunnen myeline segmenten vormen. Cellen die op deze manier zijn gegenereerd hebben potentieel aPplicaties bij autologe celtransplantatie na ruggenmergletsel, evenals bij ziekte-modellering.
Introduction
De transplantatie van neurale progenitoren en hun derivaten toont belofte als een behandelingsstrategie na traumatische zenuwletsel 1 , 2 en neurodegeneratie 3 , 4 . Voorafgaand aan de klinische toepassing is het essentieel om te verzekeren: i) een methode om toegang te krijgen tot en uit te breiden op een autologe bron van stam- / stamcellen en ii) een middel om hen naar relevante volwassen cellen te brengen 3 . Onze interesse in celtherapie voor ruggenmergbesering heeft ons geleid tot het zoeken naar een robuuste, autologe celbron van neurale progenitoren uit volwassen weefsels.
Een subpopulatie van MSC's komt uit de neurale kam en is gemakkelijk toegankelijk vanuit de mergholte. Deze cellen zijn neurale voorvaders die neuronen en glia 5 kunnen genereren. Diermodellen van cerebrale ischemie tonen aan dat hypoxie de proliferatie bevordert Inferatie en multipotentie van neurale voorlopers in de hersenen 6 . Dit was de basis voor het gebruik van hypoxische pre-conditionering als middel om uit te breiden op merg-afgeleide neurale progenitoren.
De transplantatie van Schwann-cellen in het gewonde ruggenmerg bevordert regeneratie 2 . SCLC's kunnen worden gegenereerd door MSC's door middel van supplementatie met gliogene factoren ( dwz β-Heregulin, bFGF en PDGF-AA) maar tonen fenotypische instabiliteit. Bij de terugtrekking van groeifactoren keren ze terug naar een fibroblastachtig fenotype 7 . Fenotypische instabiliteit is ongewenst bij celtransplantatie vanwege het risico op afwijkende differentiatie en carcinogenese. Aangezien de Schwann-celprecursoren geassocieerd zijn met axonbundels binnen de embryonale perifere zenuw 8 , werden we geleid tot cocultuur-SCLC's met gezuiverde embryonale DRG-neuronen 7 ,Ass = "xref"> 9. Resultaat rijpe Schwanncellen zijn lotgevonden en tonen functie in vitro 7 , 9 en in vivo 10 .
Ons protocol voor de verrijking van neurale progenitoren van MSC's is eenvoudig en efficiënt en resulteert in een toename van het celnummer voor latere analyses. De afleiding van door Schotse cellen geformuleerde schadecellen via het coculture platform zorgt voor de studie van glialifferentiatie en voor het genereren van stabiele en functionele Schwann-cellen voor potentiële klinische toepassing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is essentieel om de "stevigheid" van MSC's te behouden voorafgaand aan de verrijking van neurale voorvaders via hypoxische preconditioning en neurosfeercultuur. Uit onze ervaring kunnen multipotente MSC's betrouwbaar worden geïdentificeerd door hun langwerpige fibroblastachtige morfologie. In tegenstelling hiermee, MSCs die een meer platgemaakte, vierhoekige morfologie, met prominente cytoskeletale stressvezels hebben aangenomen, nemen niet gemakkelijk neurale celpartijen vast en dienen weggegooid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden graag Dr. Nai-Sum Wong willen erkennen voor het leveren van de hypoxie kamerapparatuur en mevrouw Alice Lui voor de technische ondersteuning.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
