Microcristalografia de Cristais de Proteína e<em> Em Cellulo</em> Difração
Summary
Um protocolo é apresentado para cristalografia de raios X usando microcristais de proteína. São comparados dois exemplos de análise de microcristos criados em vivo após purificação ou em celulósio .
Abstract
O advento de linhas de luz de microfoco de alta qualidade em muitas instalações de sincrotrona permitiu a análise de rotina de cristais menores que 10 μm em sua maior dimensão, o que representava um desafio. Apresentamos dois fluxos de trabalho alternativos para a determinação da estrutura de microcristais de proteínas por cristalografia de raios X com foco particular em cristais crescidos in vivo . Os microcristais são extraídos de células por sonicação e purificados por centrifugação diferencial, ou analisados em celulo após classificação celular por citometria de fluxo de células que contêm cristais. Opcionalmente, os cristais purificados ou as células que contêm cristais são embebidos em soluções de átomos pesados para a fase experimental. Essas amostras são então preparadas para experiências de difracção de maneira similar por aplicação em um suporte micromesh e refrigeração instantânea em nitrogênio líquido. Nós descrevemos e comparamos brevemente experiências de difracção em série de microcristais isolados e cristal-Contendo células usando uma linha de luz de sincrotron microfocus para produzir conjuntos de dados adequados para faseamento, modelagem e refinamento.
Esses fluxos de trabalho são exemplificados com cristais do poliedro Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produzido por infecção de células de insetos com um baculovírus recombinante. Neste estudo de caso, a análise do cellulo é mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produz uma estrutura em ~ 8 dias da expressão ao refinamento.
Introduction
O uso de cristalografia de raios-X para a determinação de estruturas de alta resolução de macromoléculas biológicas experimentou uma progressão constante ao longo das duas últimas décadas. A crescente aceitação da cristalografia de raios-X por pesquisadores não especializados exemplifica a democratização desta abordagem em muitos campos das ciências da vida 1 .
Historicamente, os cristais com dimensões abaixo de ~ 10 μm foram considerados desafiadores, se não inutilizáveis, para a determinação da estrutura. A crescente disponibilidade de linhas de feixe de microfoco dedicadas em fontes de radiação sincrotrona em todo o mundo e os avanços tecnológicos, como o desenvolvimento de ferramentas para manipular microcristas, eliminaram grande parte dessas barreiras que bloquearam o amplo uso da microcristalografia de raios-X. Avanços em microcristalografia serial em raios-X 2 , 3 e difração micro-eletrônica 4 haMostramos que o uso de micro e nanocristais para a determinação da estrutura não é apenas viável, mas também às vezes preferível ao uso de cristais grandes 5 , 6 , 7 .
Estes avanços foram primeiro aplicados ao estudo de péptidos 8 e cristais naturais produzidos por vírus de insetos 9 , 10 . Eles são agora utilizados para uma variedade diversificada de macromoléculas biológicas, incluindo os sistemas mais difíceis, como proteínas de membrana e grandes complexos 11 . Para facilitar a análise desses microcristais, eles foram analisados em meso , particularmente proteínas de membrana 12 e em chips de microfluídica 13 .
A disponibilidade dessas novas metodologias de microcristalografia aumentou a possibilidade de usar emCristalização in vivo como uma nova rota para biologia estrutural 14 , 15 , 16 oferecendo uma alternativa à cristalogênese clássica in vitro . Infelizmente, mesmo quando os cristais in vivo podem ser produzidos, vários obstáculos permanecem como a degradação ou perda de ligandos durante a purificação das células, a dificuldade na manipulação e visualização dos cristais na linha do sincrotrão e as tediosas experiências de difracção de raios X. Como os cristais alternativos também foram analisados diretamente dentro da célula sem qualquer passo de purificação 17 , 18 , 19 . Uma análise comparativa sugere que tal em abordagens de celulo pode ser mais eficiente do que a análise de cristais purificados e produzir dados de maior resolução 20 .
Este protocolo está emTendeu a auxiliar pesquisadores novos na microcristalografia protéica. Ele fornece metodologias com foco na preparação e manipulação de amostras para experiências de difracção de raios X em uma linha de luz de sincrotrona. Duas opções são propostas usando cristais isolados para microcristalografia clássica ou células contendo cristais classificadas por citometria de fluxo para análise celular ( Figura 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece duas abordagens para analisar os microcristais com o objetivo de facilitar a análise de cristais muito pequenos que teriam sido ignorados no passado.
Passos críticos para a purificação de microcristal
O protocolo apresentado foi otimizado usando o poliedrino Bombyx mori CPV1 expresso em células Sf9 como um modelo de sistema. No entanto, os microcristais in vivo apresentam uma grande variabilidade na resistência mecânica….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer Chan-Sien Lay por fornecer imagens de microcristais purificados, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies para obter suporte na linha de transmissão MX2 do Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga da unidade FlowCore na Universidade Monash para os seus Assistência inestimável.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
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