Microcristallografia dei cristalli proteici e<em> In Cellulo</em> Diffrazione
Summary
Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .
Abstract
L'avvento di linee di microfocus di alta qualità in molti impianti di sincrotrone ha consentito l'analisi di routine di cristalli inferiori a 10 μm nella loro dimensione più grande, che rappresentavano una sfida. Presentiamo due flussi di lavoro alternativi per la determinazione della struttura di microcristalli proteici mediante cristallografia a raggi X con particolare attenzione ai cristalli in vivo . I microcristalli vengono estratti dalle cellule per ultrasuoni e purificati mediante centrifugazione differenziale o analizzati in cellulo dopo la selezione delle cellule mediante citometria a flusso di cellule contenenti cristalli. Opzionalmente, cristalli purificati o cellule contenenti cristalli vengono imbevuti in soluzioni di atomi pesanti per la fase di sperimentazione. Questi campioni vengono quindi preparati per esperimenti di diffrazione in modo analogo mediante applicazione su un supporto micromesh e raffreddamento a flash in azoto liquido. Breve descrizione e confronto di esperimenti di diffrazione seriale di microcristalli isolati e di cristallo-Contenenti le cellule utilizzando un beamline di sincrotrino microfocus per produrre set di dati adatti per la fase di fasi, la costruzione di modelli e la raffinatezza.
Questi flussi di lavoro sono esemplificati con i cristalli del polyhedrin Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) prodotto dall'infezione di cellule insettiche con un baculovirus ricombinante. In questo caso, l'analisi cellulare è più efficace dell'analisi dei cristalli purificati e produce una struttura in ~ 8 giorni dall'espressione al raffinamento.
Introduction
L'uso della cristallografia a raggi X per la determinazione di strutture ad alta risoluzione di macromolecole biologiche ha registrato una costante progressione negli ultimi due decenni. La crescente assunzione di cristallografia a raggi X da ricercatori non esperti esemplifica la democratizzazione di questo approccio in molti settori della scienza della vita 1 .
Storicamente, i cristalli con dimensioni inferiori a ~ 10 μm sono state considerate come impegnative, se non inutilizzabili, per la determinazione della struttura. La crescente disponibilità di microfocus dedicate a fonti di radiazione di sincrotrone in tutto il mondo e progressi tecnologici, come lo sviluppo di strumenti per la manipolazione dei microcristalli, hanno rimosso gran parte di queste barriere che hanno ostacolato l'ampio utilizzo della microcristallografia a raggi X. Avanzamenti nella microcristallografia a raggi X seriali 2 , 3 e diffrazione a micro elettronica 4 haVe ha mostrato che l'uso di micro- e nanocristalli per la determinazione della struttura non è solo possibile ma anche a volte preferibile all'uso di grandi cristalli 5 , 6 , 7 .
Questi progressi sono stati applicati per lo studio dei peptidi 8 e dei cristalli naturali prodotti dai virus degli insetti 9 , 10 . Sono ora utilizzati per una vasta gamma di macromolecole biologiche tra cui i sistemi più difficili come le proteine a membrana e grandi complessi 11 . Per facilitare l'analisi di questi microcristalli, sono stati analizzati in meso, proteine di membrana 12 in particolare e in chips microfluidica 13.
La disponibilità di queste metodologie microcristallografia nuovi ha sollevato la possibilità di utilizzare inCristallizzazione vivo come un nuovo percorso per la biologia strutturale 14 , 15 , 16 che offre un'alternativa alla cristallogenesi classica in vitro . Purtroppo, anche quando si possono produrre cristalli in vivo , rimangono diversi ostacoli quali la degradazione o la perdita di ligandi durante la depurazione dalle cellule, la difficoltà nella manipolazione e la visualizzazione dei cristalli alla radiazione di sincrotrone e negli esperimenti di diffusione a raggi X. Come cristalli alternativi sono stati analizzati anche direttamente all'interno della cella senza alcuna fase di purificazione 17 , 18 , 19 . Un'analisi comparativa suggerisce che tali approcci cellulari possono essere più efficienti dell'analisi dei cristalli purificati e dei dati di resa di maggiore risoluzione 20 .
Questo protocollo è inTendeva ad aiutare i ricercatori alla microcristallografia delle proteine. Fornisce metodologie che si concentrano sulla preparazione e manipolazione del campione per gli esperimenti di diffrazione a raggi X in un beamline di sincrotrone. Si propongono due opzioni utilizzando cristalli isolati per microcristallografia classica o cellule contenenti cristalli ordinate per citometria a flusso per l'analisi cellulare ( Figura 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce due approcci per analizzare i microcristalli allo scopo di facilitare l'analisi di cristalli molto piccoli che sarebbero stati trascurati in passato.
Fasi critiche per la purificazione microcristallina
Il protocollo presentato è stato ottimizzato utilizzando il polyhedrin Bombyx mori CPV1 espresso in cellule Sf9 come sistema di modello. Tuttavia, i microcristalli in vivo presentano una grande variabilità nella resiste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Chan-Sien Lay per fornire immagini di microcristalli purificati, Daniel Eriksson e Tom Caradoc-Davies per il supporto alla linea MX2 del Synchrotron australiano e Kathryn Flanagan e Andrew Fryga della struttura FlowCore presso la Monash University per la loro Un'assistenza inestimabile.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
