Microcristallographie des cristaux de protéines et<em> Dans Cellulo</em> Diffraction
Summary
Un protocole est présenté pour la cristallographie aux rayons X en utilisant des microcristaux protéiques. Deux exemples analysant les microcristaux végétaux in vivo après purification ou en cellulo sont comparés.
Abstract
L'avènement de lignes de feu de microfocus de haute qualité dans de nombreuses installations synchrotron a permis l'analyse de routine de cristaux inférieurs à 10 μm dans leur plus grande dimension, ce qui représentait un défi. Nous présentons deux flux de travail alternatifs pour la détermination de la structure des microcristaux protéiques par cristallographie aux rayons X avec un accent particulier sur les cristaux cultivés in vivo . Les microcristaux sont soit extraits de cellules par sonication et purifiés par centrifugation différentielle, soit analysés en cellulo après triage cellulaire par cytométrie en flux de cellules contenant des cristaux. Facultativement, les cristaux purifiés ou les cellules contenant des cristaux sont trempés dans des solutions d'atomes lourds pour le phasage expérimental. Ces échantillons sont ensuite préparés pour des expériences de diffraction de manière similaire par application sur un support micromesh et refroidissement instantané dans de l'azote liquide. Nous décrivons brièvement et comparons les expériences de diffraction en série de microcristaux isolés et de cristaux-Contenant des cellules à l'aide d'une ligne de rayonnement synchrotron microfocus pour produire des jeux de données appropriés pour la mise au point, la construction de modèles et le raffinement.
Ces flux de travail sont illustrés par des cristaux de la polyhédrine Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) produits par l'infection de cellules d'insectes avec un baculovirus recombinant. Dans cette étude de cas, l'analyse cellulo est plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et donne une structure en ~ 8 jours de l'expression au raffinement.
Introduction
L'utilisation de la cristallographie aux rayons X pour la détermination des structures à haute résolution des macromolécules biologiques a connu une progression constante au cours des deux dernières décennies. L'adoption croissante de la cristallographie par rayons X par des chercheurs non experts illustre la démocratisation de cette approche dans de nombreux domaines des sciences de la vie 1 .
Historiquement, les cristaux ayant des dimensions inférieures à ~ 10 μm ont été considérés comme difficiles, sinon inutilisables, pour la détermination de la structure. La disponibilité croissante de rayons microfocus dédiés sur les sources de rayonnement synchrotron à l'échelle mondiale et les progrès technologiques, tels que le développement d'outils pour manipuler les microcristaux, ont éliminé une grande partie de ces barrières qui empêchaient l'utilisation étendue de la microcristallographie aux rayons X. Les progrès de la microcrystallographie en série X 2 , 3 et la diffraction micro-électronique 4 haNous avons montré que l'utilisation de micro et nanocristaux pour la détermination de la structure n'est pas seulement possible mais aussi parfois préférable à l'utilisation de gros cristaux 5 , 6 , 7 .
Ces progrès ont d'abord été appliqués à l'étude des peptides 8 et des cristaux naturels produits par les virus des insectes 9 , 10 . Ils sont maintenant utilisés pour une gamme variée de macromolécules biologiques, y compris les systèmes les plus difficiles tels que les protéines membranaires et les grands complexes 11 . Pour faciliter l'analyse de ces microcristaux, ils ont été analysés dans le méso , en particulier les protéines membranaires 12 et dans les puces microfluidiques 13 .
La disponibilité de ces nouvelles méthodes de microcristallographie a soulevé la possibilité d'utiliser enCristallisation vivante comme nouvelle voie pour la biologie structurale 14 , 15 , 16 offrant une alternative à la cristallogénèse classique in vitro . Malheureusement, même lorsque des cristaux in vivo peuvent être produits, plusieurs obstacles demeurent tels que la dégradation ou la perte de ligands lors de la purification des cellules, la difficulté de manipulation et de visualisation des cristaux à la ligne du synchrotron et des expériences fastidieuses de diffraction des rayons X. Comme une alternative, les cristaux ont également été analysés directement dans la cellule sans aucune étape de purification 17 , 18 , 19 . Une analyse comparative suggère que, dans les approches cellulo , peut être plus efficace que l'analyse des cristaux purifiés et produire des données de résolution supérieure 20 .
Ce protocole est enOnt tendance à aider les chercheurs nouveaux à la microcristallisation des protéines. Il fournit des méthodologies axées sur la préparation et la manipulation des échantillons pour les expériences de diffraction des rayons X à une ligne de rayonnement synchrotron. Deux options sont proposées en utilisant des cristaux isolés pour la microcristallographie classique ou des cellules contenant des cristaux triés par cytométrie de flux pour l'analyse cellulo ( Figure 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole fournit deux approches pour analyser les microcristaux dans le but de faciliter l'analyse de très petits cristaux qui auraient été négligés par le passé.
Mesures critiques pour la purification du microcristal
Le protocole présenté a été optimisé en utilisant la polyhédrine Bombyx mori CPV1 exprimée dans les cellules Sf9 en tant que système modèle. Cependant, les microcristaux in vivo présentent une grande var…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Chan-Sien Lay pour avoir fourni des images de microcristaux purifiés, Daniel Eriksson et Tom Caradoc-Davies pour le soutien de la ligne MX2 du Synchrotron australien, et Kathryn Flanagan et Andrew Fryga de l'installation FlowCore à l'Université Monash pour leur Aide inestimable.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
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