固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

1 です固体 NMR サンプル productiona 均一に 13 C の生産/15 N 標識タンパク質サブユニット 使用新鮮な変換、pET24 ペプチド 6his プラスミドを含む。大腸菌 BL21 (DE3) セル準備の寒天からそれらを収穫します。 は、1 つのコロニーに予め温めておいた LB 培地の 15 mL の前培養を接種します。200 rpm 揺れ一晩で 37 ° C で。 は予め温めておいた M9 媒体の主要な文化の 1 L に前培養を転送 (表 1 の構成を参照)、必要な同位体標識炭素・窒素ソースを含むします 。 注: これは、一様に 13 C 標識グルコース、選択的に (1-13 C)- または (2-13 C)-グルコース 29 , 30 , 31 または (ラベルの付いた1, 3-13 C)- または (2-13 C)-グリセロール 32 , 33 のラベルします。 は、37 ° C でこれをインキュベートし、文化が濁りになるとすぐ OD 600 を測定します。外径 600 が 0.8 の値に達したら、0.75 mM IPTG 4 h とタンパク質発現を誘導する メモ: 別に一つの蛋白質からその最適な誘導条件の異なることができます。 G x 6000 と 4 で 30 分間の遠心分離によって細胞を回復 ° C 浄化のスケッチ (ビデオ プロトコルに非表示) リゾチームや超音波治療など標準の手法を用いた細胞を溶解し、浄化技術確立やバリアフリーを使用して蛋白質の亜単位、蛋白質のアセンブリを検討します 。 注: タンパク質で表現できる封入体チェック蛋白質のローカリゼーションのセル換散およびその後遠心分離によって。それが封入体で蓄積されているタンパク質が細胞の残骸が堆積物で見つかった場合。 テスト式と標準の 12-15% トリス トリシン SDS-ページ、によって例えば蛋白質のサンプルの純度は、 図 2 a を参照してください。純度のタンパク質を組み立てることができますで十分な場合それ以外の場合補足の精製ステップを実行します。 蛋白質のフィラメントのアセンブリ 精製タンパク質濃度を確認してください。タンパク質には、吸収の残基が含まれている場合、280 紫外線分光光度計での吸収を測定 nm。分光光度計校正として純粋なバッファーに挿入し、タンパク質の吸光度を測定し。 計算蛋白質の集中の蛋白質の亜単位の吸収係数を用いた適応のビール ランベルトの法則: λ = ε λ l x 特定波長 λ; c; ここで A は光 x 密度 ε は、特定の吸収係数;l は cm で光の軌道の長さc は mol/L で濃度 は、遠心ろ過ユニットで 1 mM の濃度にタンパク質を集中します。遠心フィルター ユニットにサンプルを紹介し 30 分間 4000 × g で遠心分離、フィルターで蛋白質の沈着を避けるためにピペットを使い、優しくフィルター ユニットでソリューションをミックスします。希望の濃度に到達するまでの手順を繰り返します 。 注: 最適なアセンブリ濃度システムに依存し、(0.1 – 1 mM) の間に通常を最適化する必要があります。2 つの異なるラベルの付いたタンパク質バッチのサンプルを準備、等モル混合ラベル付けされた場合 (例えば (50/50) (u-15 N)-/(u-13 C)-ラベル) 前、にまたは確保するため濃度ステップの直後に場所を取る必要があります混合混合液の均質化します。 チューブにサンプルを転送し、室温で 1 週間撹拌下でインキュベートします。 フィラメントにサブユニットの重合通常混濁ソリューションと一緒に伴われます。たとえば電子顕微鏡 (倍率 X – 45000 X 6300) による微細な線維の形態と均質性をチェック、 図 2 b を参照してください。 G x 20000 と 4 で 1 時間サンプル遠心分離機 ° c. の削除、上清の大半はサンプルの乾燥を避けるために表面をカバーする十分な液のみを残します。紫外線分光光度計に非組み立てサブユニットの上澄みを確認してください。 洗う H 2 O を追加してサンプルと慎重なピペットとコンテンツを再懸濁します。ボルテックスにかけないでください。22000 g x と 4 で 30 分のサンプルをスピン ° C は洗濯手順を 3 回繰り返します。すべての洗浄のステップ中にペレットを保持その側面遠心分離後で、紫外線分光光度計に非組み立てサブユニットの上澄みをチェックします。 4 で測定まで 0.02% (w/v) アジ化ナトリウム (NaN 3) 細菌汚染を避けるために、サンプルの保存を追加 ° C 固体 NMR ローター充填 x g と上清の 4 ° C 削除最大量 22000 で 30 分の 2 回遠心分離機; その結果サンプル一貫性蛋白質アセンブリによって異なります、通常ゲル状預金します。 キャピラリー ピペットを使用して SSNMR ローターにサンプルを挿入します 。 注: ここでは、4 mm 径のローターに手順を提示します。 遠心ローター テーブルにそっとローターにサンプルを導入する遠心分離します。ローターをいっぱいになるまで、手順を繰り返します。ローター キャップとローターを閉じるに最小スペースを維持します。サンプル量が不足している場合紹介ローターでサンプル分布の均一性を確保するための残りのスペースを埋めるため市販挿入します 。 注: 依存組み立てサンプルの一貫性に非常に密なサンプルの特に薄いヘラを使用するより適切な場合があります。中程度の MAS 周波数 2.5 〜 4 ミリメートルの直径とローターを使用します。 内部の化学シフトと温度校正用 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 酸 (DSS) のトレースを追加します。 開閉装置とキャップを閉じます。 キャップも挿入し、完全に閉じた場合拡大鏡下でチェックしてください。 図 2: 代表結果蛋白質サブユニットの浄化およびアセンブリ。A) 15% 蛋白質の亜単位のトリス トリシン SDS-PAGE (彼の 6 を含む-タグ) 浄化のさまざまな段階で。レーン 1 – タンパク質分子量マーカーレーン 2 – 大腸菌 BL21 (DE3) 細胞未誘導制御;レーン 3 – 大腸菌 BL21 (DE3) 細胞 0.75 mM IPTG;レーン 4 – 可溶化封入体レーン 5 – 細胞ライセート; の上清分画車線 6 – 精製割合ニッケル固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) FPLC と脱塩後です。B) は否定的電子顕微鏡イメージングによる蛋白質の原繊維を染色しました。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 2 事前構造評価による一次元 (1 D) 固体 NMR 初期設定と 1 次元交差偏波 (CP) NMR 磁石にローターを挿入 を開始。5 kHz の周波数でローターを回転し、± 10 Hz の安定待ち、7 kHz まで加速します。チューニング、1 H、13 C、15 N チャンネルに一致します。2-10 ° C (275-283 K) に温度を設定します。サンプル 7 kHz マスで暖房が低いと温度調整は通常この MAS 周波数で必要はありません。 記録の 16 回のスキャンを用いた単一パルス 1 D 1 H スペクトル 。 注意: 電力レベルする必要があります以前に最適化されている参照化合物 (13 C など/ ^{15 N ヒスチジンまたはグリシン)、ターゲット サンプルの実験で電力レベルを最適化するための初期値を提供するためにこの手順が定期的な仕事であり、このプロトコルではスコープ外。 は、温度、DSS 信号 34 に関して一括水 1 H の共鳴の相対シフトに反映されます水和物試料中の 2-10 ° C の間のすべての実験の間に温度を保ちます。次の関係 δ (H 2 O) 温度測定 = 7.83-T/96.9 1-2 ° C 35 の精度と。 目的を セット MAS 周波数と ± 10 Hz の安定化まで待ちます 。 注: ここでそれは 11 の kHz の頻度の実証です。 チャンネルは再び曲と一致 1 H と 13 C と 1 D 1 H 実験の助けを借りて、温度を調整します。 1 D 1 h-13 C CP 36 設定します 。 注: CP 実験は、剛構造の残基から生じる信号を表示します。パルス調整と分離パラメーター最適化すること直接サンプルに感度が十分に高い未満 32 〜 スキャン後の信号を観察するとき。最初の最適化の値は参照化合物の標準的な最適化から引き継がれる。CP の接触時間と電力レベルは、最大信号強度に基づいて選択されます。蛋白質のサンプルの最適な CP の接触時間は 200 μ s と参照化合物の校正からデカップリングのパラメーターする必要があります再調整も 2 さんの通常です。 慎重に回転して与えられた MAS 周波数で側波帯の局在を観察。 1 D スペクトル指紋として機能参照 1 D 13 C CP スペクトルを記録。代表的なパラメーターは、1 ms CP 接触時間、強さ、3 s のリサイクル遅延、25 ms の買収をデカップリング 100 kHz、128 スキャンします。 は、1 H、13 C の化学シフト IUPAC 勧告 37 次を調整します。1 H DSS 信号 (0 ppm の化学シフト) の共振周波数を決定します。13C 化学シフトは 1 H シフト (通常 〜 0.25144、1 H の共鳴周波数 37 13 C の比から派生) に参照されます。 1 D 1 h-13 C CP アポダイゼーションすることがなく実験プロセス機能 (均一によく発注された蛋白質のアセンブリの検出のため 図 3 a と B を参照)。サンプルでは、構造秩序と同質性を示すもので線幅を推定する隔離されたピークを選択します。強磁場下でマスの下でよく整理された生物的蛋白質アセンブリの典型的な 13 C スペクトル線幅の範囲 20-150 Hz (ハーフハイト (FWHH) でのフル幅として測定). CP スペクトル信号対雑音 (S/N) 比を推定します 。 注: S/N 比はローター、タンパク質立体構造の剛性と単一分子のコンホメーションの存在性で主にサンプルの量を含む多くの要因に依存します。親指のルールとして、サンプルに適しているべき多次元 SSNMR 分光 64 スキャンで記録、1 D 1 h-13 C CP スペクトル最適化された信号が観察される場合。 は、(主に) 165-180 ppm 間ローカライズ蛋白質のバックボーン カルボニル共鳴の分光地域にズームします。Α-ヘリックスの残基からの共鳴と蛋白質のバックボーン カルボニル共鳴の位置でアセンブリに二次構造体の内容を推定または β ストランド構造シフト敵陣やシフト、それぞれ (を参照ほとんどの α-ヘリックスのサブユニットの 図 3 b) 38. 1 D INEPT 実験 蛋白質アセンブリの高度なモバイル パーツ (サブ μ s) をプローブする 1 D 1 h-13 C 不適切な実験を設定します 。 注: ガープが集録 39 の間にデカップリング数 kHz の一般的に使用される短い interscan の遅延を許容する (通常 1 s) プローブを損なわないで。 モバイル タンパク質セグメントの指紋として機能する参照の不適切なスペクトルを記録; 一般的なパラメーターは、128 のスキャンと 25 さんの取得時間 プロセス、1 h-13 C 不適切な実験します。量と信号の位置は、それぞれモバイル残基のアミノ酸組成の量を示すもの 。 メモ: は、信号が 1 D 不適切なスペクトルに存在する場合も 2 D 1 h-13 C 不適切な実験を記録 (例については 図 3 を参照) より特定アミノ酸識別を許可します。あいまいな割り当ての場合、溶液 nmr 法によるバッファー コンポーネント信号位置をチェックをお勧めします。 スペクトルない場合モバイル バッファー コンポーネントのみが保持; BMRB データベース 40 を使用し、ランダム コイル構造の近くで彼らの対応するアミノ酸に共鳴を割り当てるデータ 38 を公開残基は、高度なモバイル政権。 図 3: の代表の結果適切に構成された蛋白質のアセンブリの SSNMR スペクトル取得。) 13 1 h-13 C 交差偏波実験の FID を C が検出されました。B) 1 H-13 C 交差偏波実験。C) 1 H-13 硬質蛋白質アセンブリ; C 不適切な実験バッファーのコンポーネントのみが表示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 3. 立体配座解析と 3次元構造決定 の シーケンシャル共鳴割り当て 設定 2 D 13 c-13 C プロトン駆動型スピン拡散 (PDSD) 41 は側鎖を含む内残渣 13 c-13 C 相関を検出する実験します。H – 13 C CP 実験 1 D 1 から最初の 1 H-13 C 交差偏波ステップの値を引き継ぐ。 混合時間均一に 13 C ラベル サンプルを 50 ms に設定 100 ms 選択的に 13 C ラベル サンプル。5 25 ms と 15-25 ms (に代表される自由誘導減衰 (FID) 長さで目に見えるシグナルによって推定することができます固有のスペクトル分解能に依存している間直接取得と間接取得時間を設定します。 図 3 a). スペクトルの信号をノイズと解像度に関して最適な値を見つけるにいくつかの処理パラメーターをテスト、2.5-4 の正弦ベル シフト (SSB) と qsine ウィンドウ関数を使用して適切な処理を達成できる通常。 連続 13 c-13 C 相関関係ほとんど私 – i±1 の接続を検出するレコードと 2 D 13 c-13 C PDSD 中間混合時間実験のプロセスを設定、また i±2 と i±3残基蛋白質のバックボーンの剛性と二次構造の要素によって。混合時間は、均一にラベル付けされたサンプルの 100-200 ms 間設定必要があります。その他のすべての値は、混合時間 2 D 13 c-13 C PDSD 短いから引き継ぐことができる。 は、レコードと 2D 15 N – 13 C N 私 CA 私 と N 私 CO 私 実験 CP 1 H-15 N と特定 CP 15 N-13 C 転送を使用してプロセスを設定 42。 それぞれの CA またはカルボニル地域最大強度に基づく興味のサンプルに直接 1 D ファッションの 15 N-13 C 偏波の転送を最適化します。入力ゲーム特定 CP 接触時間の cal 値 2-6 さんの間にある レコードと 2 D 15 n-(13 c) 13 C シリーズ実験割り当ての目的のためのプロセスを設定します 。 注: 最初の 15 N-13 C 偏波転送パラメーター値引き継ぐことができる N 私 CA は 私 から N 私 CO 私 実験/。内残留物の相関関係が (CA 私) CB 私 と N 私 (CA 私) CO 私、それぞれを使用しての夢 43 PDSD 13 c-13 C N は 私 から確立します。偏光を転送します。実験では, N 私 (CO i-1) CA i-1 と N 私 (CO i-1) CX i-1 から残渣 (i) 残基 (i-1) 順次接続を取得両方 PDSD 13 c-13 C を使用して偏極移行します。 CcpNmr 解析 44 やスパーキー 45 などの選択、NMR 解析プログラム 2次元スペクトルを読み込む (CcpNmr による例示) ソフトウェアと主蛋白質シーケンスを読み込む。 は C-13 C PDSD スペクトル短い混合 13 に表示されているアミノ酸の種類の識別を開始します。接続を許可するようにスピン系の炭素原子、" 残留防止タイプ " 特定の割り当て;スレオニン残基の割り当ての 図 4 a を参照してください。限りとして多くの残余を識別します。これは蛋白質サブユニット サイズ、スペクトル分解能、分散に依存します。 オーバーレイ 13 c-13 C PDSD の中間混合スペクトルを持つ短いミキシングします 。 注: 主から順次発生する中間混合 PDSD の表示補助のピーク (残渣残渣 i±1 i-) 連絡先。 図 4 b に 2 残基順次割り当ての例を示します。 は、スピン系の共鳴ピークをマークし、他のスピン系の共鳴周波数を持つ中間混合 PDSD の相関関係を見つけます。小さなタンパク質またはペプチドで、それは 2 D 13 c-13 C PDSD 実験に基づいて全体のシーケンシャル共鳴割り当てを達成するためにことが可能です 。 注: で β ストランド二次構造モチーフ残渣 i – 残渣 i±2 13 C – 13 C 連絡先表示される空間の近さによるシーケンシャル連絡先よりもより強い信号強烈な信号に α ヘリックスの二次構造モチーフ残渣の i – 残渣 i±3 13 C – 13 C 接点がつながることができます。 選択的 13 C 標識サンプルの中間混合 PDSD 実験がある場合短い混合スペクトルの上に重ねて (で使用できる場合、選択的 13 C 標識サンプル) 補足を割り当てるとピーク、選択的 13 C 標識を考慮してパターン (1, 3 – 13 C と 2 – 13 C グリセリン 32 , 33 または 1-13 C と 2 の 13 C グルコース 29, 30, 31 注: などで 2-13 C グリセロール標識アミノ酸各種が隣接する炭素せず先端位置のラベルの付いたサンプル (Cβ と C ') というラベルの付いた、したがって先端先端を優遇。隣接する残基間で転送します。選択的にラベルのサンプルで長距離 13 c-13 C 相関が既にで造り上げる中間混合 13 c-13 C PDSD 実験。ピークは、逐次相関関数では説明できない、それが長距離の接触から発生する可能性があります。高い高分子アセンブリの均質なサブユニット構造を注文、共鳴の 1 つだけセットはスペクトルで表示されるようになっています。共鳴が 13 C 原子の表示されて倍増した (またはさらに乗算) または蛋白質のバックボーン ストレッチ、原子またはアセンブリ内の一次配列ストレッチ 2 つ (またはそれ以上) 構造をとりうるが、それぞれ存在します。 は、各残基の 15 N 共振周波数を識別するために内残渣 15 N – 13 先端相関を含む 2D の NCA スペクトルを使用します。13 C の寸法での解像度が十分ではない場合は内残留物の 15 N 共振周波数を識別するために 2 D の NCACB で Cβ 共鳴に関する補足情報を使用します。 は、(i) 内残留物の 15 N 周波数を識別し、(ii) 13 c-13 C のあいまいさを解決する 2 D NCACB と NCACO スペクトル内残留物の 15 N – 13 c-13 C 相関関係を含むを使用してください。追加の 15 N の次元の助けを借りて、PDSD。夢移転に伴う信号の反転は、典型的な先端 Cβ 相関先端信号は正と負の Cβ 信号の観測に します。さらに側鎖の 13 C、スペクトルで表示されている場合は、肯定的な再び。 図 4: 2 次元 13C-13 C SSNMR PDSD が均一によく注文に関する実験 13 C, 15 N 標識蛋白質のアセンブリ。A) 短い混合時間 PDSD (混合 50 ms)。B) 長いミキシング時間 PDSD (200 ms 混合) 混合時間が短い PDSD のオーバーレイを用いた 2 残基ストレッチ Ile32 – Thr33 の割り当て。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 二次構造決定 13 先端を使用して、二次化学を計算する 13 Cβ 化学シフト値シフト 46 ΔδCα ΔδCβ、二次構造を示す。13 – 13 先端 (ランダム コイル) と 13 Cβ(assigned) – Cα(assigned) 13 Cβ (ランダム コイル) を計算します 。 注: ランダム コイル構造の残基の化学シフト値は 38 から入手することができます。 プロット ΔδCα-ΔδCβ、正または負の値 > 行の 3 残基はそれぞれ β ストランドまたは α-ヘリックス構造を示す; グリシンとプロリン残基として珍しい化学シフト値を表示可能性があります彼らは多くの場合として " 二次構造ブレーカー ". タロス + 47 , 48 または PREDITOR 49 , 50 を使用して割り当てられた化学シフトからタンパク質二面角を予測します。ピピ/Psi、二面角を予測タンパク質 subu の二次構造を反映します。nit とモデリング プロセス全体を通じて構造的制約を使用します。 構造制約のコレクション 設定し、2 D 13 C – 長距離 13 C を検出する長い混合時間と 13 C PDSD 実験 – 13 C の相関関係を記録します。範囲 400 ms から 1 回で典型的な混合米使用選択的 13 C ラベル サンプル、スピン希釈が遠い炭素間で偏波伝達を大幅に向上します。 オーバーレイ ロング混合 2 D 13 c-13 C PDSD 記録中間混合 13 に選択的にラベルのサンプル C-13 C PDSD、可能であれば同じ選択ラベル サンプルの記録。補足的なピークはより遠くの 13 C 原子間の相関に起因します。考慮に入れる共鳴割り当て中に選択的ラベル付けスキーム。 は、割り当てトレランス ウィンドウ、すなわち 共鳴のシグナルに貢献することができますこの特定の ppm の範囲のスペクトル分解能に依存を定義するスペクトルの解像度を慎重に評価します。割り当て精度の標準偏差は CcpNmr 分析などスパーキー NMR 割り当てプログラムで自動的に計算されます。 信号は連続で説明できるなら (残渣残渣 i±1 – 私) または中型の範囲 13 c-13 C 連絡先 (残基-残渣私 ± 2、3 または 4)、中継された分極以来この割り当てを維持転送を説明することができます、13 c-13 C の距離が予想される表示連絡先の範囲を超える場合も相関。 は、明確かつ曖昧な周波数に長距離 13 c-13 C 連絡先の割り当てを分類します。周波数の明確な割り当て、場合 1 つだけ共鳴割り当て割り当てトレランス ウィンドウに対して可能です 。 注: あいまいな割り当ては、許容値ウィンドウ内のすべての可能な共鳴割り当てを含みます。あいまいさして解除できます同時に構造計算時にアリアなど計算ルーチンで実行同様明確な制約のみを使用して計算予備の構造に基づく曖昧さ回避の繰り返しラウンド 51 またはユニオ 52。さらに、異なる生物物理源 (例えば 変異またはサブユニット構造を NMR や x 線結晶構造解析、長さあたりの質量測定、低温電子顕微鏡マップによって切り捨てられる) からの構造データも使えるため、あいまいさのレベルを減らすために例 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 を参照してください。, 57, 58 対称蛋白質の分子間の距離制約の検出 で 2 d 15 N-13 C 痛み CP 59 実験を設定。混合 (50/50) u-15 n-/u-13 C 標識サンプル。痛み CP スペクトル上で検出された信号は、分子間の 15 N – 13 C の近接電波から起こるべき。以前割り当てられた共鳴を使用して分子間接触の割り当てを実行します。 設定 2 D 13 c-13 C PDSD 長い混合時間 (> 600 ms) (50/50) の混合 (1, 3-13 C)-/(2-13 C)-グリセロールまたは (1-13 C)-/(2-13 C)-グルコース サンプル 。 注: にこの 13 c-13 C スペクトル信号分子内および分子間の 13 から c-13 C 近接電波を発生します。ただし、2 つのラベル付けスキームの高い補完できます分子間接触、例えばセリン CA に起因する明確に特定共鳴組、(2-13 C)-グルコースのセリン CB を関連付けるサブユニットをラベル付け、(1 – 13 C)-グルコースのサブユニットをラベル付けします。 2D 13 c-13 C スペクトルに混合試料のスペクトルは、同質ラベルに記録されたオーバーレイがサンプル ((1,3-13C) – と (2-13 C)-グリセロールまたは (1-13 C)-、(2-13 C)-グルコースサンプルのラベル)。混合サンプルの記録されたスペクトルの分子間相互作用から生じる。 SSNMR データからモデルを構造 構造計算に必要な SSNMR 拘束リストを準備: (1) 蛋白質シーケンス;(2) 分子内の明確な距離の制約。(3) 分子内のあいまいな距離拘束;(4) タロス ベース二面角拘束;(5) 分子間の明確な距離の制約。(6) 分子間のあいまいな距離拘束;(他の生物物理学的手法 (例えば、長さあたりの質量対称性パラメーター) 7) その他のデータ。 いくつかのレビューは、相補的な構造データ 14 , 60 , 15 と組み合わせて SSNMR データに基づいた構造モデリングに対する洞察を提供 、 19 , 61 , 62 予備的な構造計算の中にあいまいな距離の制約を区別できるように注意してください明確な距離の制約に基づく構造モデル。構造精度を確保、注意深く観察構造が単一の倍に収束かどうか。 図 5 : 内と分子間対称蛋白質アセンブリ内の連絡先。らせん高分子アセンブリの内 – 対 分子間 13 C – 13 C 長距離接触の模式図。サブユニットは白とサブユニットの混合ラベル; すなわち アセンブリの 2 つの異なるラベル付けスキームの 1:1 混合物が実行された前に説明するために赤で着色されている (例えば 1-13 C グルコースと 1 – 13 C グルコース). A) 分子内 13 c-13 C 長距離接触 (青い破線矢印); B) 分子間 13 c-13 C 長距離接触 (赤矢印は破線). この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。}