Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Antoine Loquet; James Tolchard; Melanie Berbon; Denis Martinez; Birgit Habenstein

doi:10.3791/55779

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Published: September 17, 2017

doi:

10.3791/55779

Antoine Loquet¹, James Tolchard¹, Melanie Berbon¹, Denis Martinez¹, Birgit Habenstein¹

¹Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects,UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

Summary

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

Abstract

חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ממלאים תפקידים מהותי בתהליכים ביולוגיים החל פתוגן-פונדקאי אינטראקציה, זיהום נגיפי כדי התפשטות של מחלות ניווניות. כזה מכלולים מורכבים ב מרובים החלבוניות מאורגנות בדרך שאינה קוולנטיות כדי ליצור אובייקטים macromolecular גדולים זה יכול לבצע מגוון רחב של פונקציות הסלולר או לגרום לכך השלכות מזיקות. אטומי תובנות המנגנונים הרכבה לבין תפקוד הרכבות macromolecular האלה נשארים לעיתים קרובות נדיר מאז שלהם insolubility הגלום ומפחית הלא-crystallinity לעיתים קרובות באופן דרסטי את איכות הנתונים המתקבלים רוב טכניקות בשימוש הביולוגיה המבנית כדוגמת קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והפתרון תהודה מגנטית גרעינית (NMR). אנו מציגים כאן הקסם-זווית ספינינג NMR של מצב מוצק ספקטרוסקופיה (SSNMR) כשיטת רבי עוצמה כדי לחקור מבנים מכלולים macromolecular ברזולוציה אטומית. SSNMR יכול לחשוף פרטים אטומית על המתחם שהורכב ללא מגבלות גודל, המסיסות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השלבים החיוניים מן הייצור של ¹³C /¹⁵N התווית על-ידי איזוטופ חלבון macromolecular להרכבות רכישת סטנדרטי SSNMR ספקטרה, שלהם ניתוח ופרשנות. לדוגמה, אנו מראים את הצינור של ניתוח מבני SSNMR של אסיפה חלבון filamentous.

Introduction

ההתקדמות קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (SSNMR) מציעים כלי יעיל עבור אפיון מבניים חלבון macromolecular הרכבות ברזולוציה האטום. מהרכבות חלבונים אלה הן מערכות בכל מקום זה ממלאים תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים רבים. מבנים מולקולריים שלהם, אינטראקציות, דינמיקה הינן נגישות באמצעות מחקרים SSNMR, כפי שהוצגה עבור נגיפי (capsids¹) ואת מנגנוני זיהום חיידקי (הפרשת מערכות²^,³, pili⁴), קרום חלבון מתחמי⁵^,⁶^,⁷^,⁸ , amyloids תפקודית ⁹^,¹⁰^,¹¹. הרכבה מולקולרי מסוג זה יכול גם לעורר פתולוגיות כגון מחלות ניווניות היכן חלבונים להרכיב במדינות misfolded, עמילואיד ולגרום בהתנהגות התא חריגה או לתא המוות ¹²^,¹³. חלבון הרכבות, שנבנו על ידי oligomerization סימטרי עותקים בכפולות של החלבוניות לעצמים סופרא מולקולרית גדולים של צורות שונות כולל הסיבים, חוטים, נקבוביות, צינורות או חלקיקים. הארכיטקטורה רבעוני מוגדרת על ידי החלשים האינטראקציות בין החלבוניות כדי לארגן את מכלול יכולות וכדי לאפשר תפקודים ביולוגיים מתוחכמים. חקירות מבניים בקנה מידה אטומי על מהרכבות אלה הם אתגר עבור טכניקות ברזולוציה גבוהה מאז insolubility מהותי שלהם, לעיתים קרובות שלהם crystallinity ללא הגבלת השימוש קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן קונבנציונאלי או פתרון NMR גישות. קסם-זווית ספינינג (MAS) SSNMR המתעוררים הטכניקה כדי לקבל נתונים ברזולוציה אטומית על הרכבות macromolecular לא מסיסים, הוכיחה את יעילותה לפתרון אטומי דגמי תלת-ממד עבור מספר גדל והולך של מערכות למערכות ביולוגיות מורכבות כולל חוטים חיידקי, הרכבות עמילואיד, נגיפים ¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^, ²¹^,²². ההתקדמות הטכנית על שדות מגנטיים גבוהה, התפתחויות מתודולוגיות הכנת הדוגמא הקימה MAS SSNMR לתוך שיטה חזקה לחקור חלבונים לא מסיסים בסביבות שונות, ובייחוד ב שלהם מבחינה ביולוגית רלוונטיות macromolecular התאספו המדינה או ממברנות הסלולר, ביצוע הטכניקה מאוד משלים הקפאה-מיקרוסקופ. במקרים רבים, רמה גבוהה מאוד של סימטריה מאפיינת את הרכבות חלבון כזה. MAS SSNMR מנצל תכונה זו, כמו כל החלבוניות בהרכבה homomolecular באותו מבנה מקומי, ולכן כמעט זהה SSNMR חתימה, באופן דרסטי הפחתת המורכבות של הניתוח.

פרוטוקול יעילה ללימודי מבנית של חלבון macromolecular הרכבות על ידי MAS מתונה (< 25 kHz) SSNMR מוצג בסרטון הזה, נחלקים שלבים שונים (איור 1). נדגים את השלבים הקריטיים של זרימת העבודה של מחקר מבנית SSNMR ביטוי על חלבון filamentous אסיפה (ראה מודגש צעדים באיור1), למעט חלבון יחידה משנית-טיהור, שונות עבור כל חלבון הרכבה, אבל חשיבות קריטית ללימודי מבניים, ומבלי אכנס לפרטי פרטים טכניים/מתודולוגיים SSNMR ספקטרוסקופיה ומבנה חישוב עבור מה הדרכות מיוחדות זמינים באינטרנט. בעוד בפרוטוקול הנוכחי יתמקד בעיקר ניסויים NMR של מצב מוצק תחת תנאים MAS, השימוש מיושר סביבות ביולוגי ²³^,²⁴^,²⁵^,²⁶ ^, ²⁷, כגון bicelles מיושר, לאפשר החקירה של חלבון קונפורמציה ואינטראקציה דינמי חלבון קרום דמוי בתקשורת ללא טכנולוגיית MAS. אנחנו נראה את הביטוי חלבון, מכלול צעדים, כמו גם את ההקלטה של ספקטרום SSNMR מכריע, ניתוח ופרשנות שלהם. המטרה שלנו היא לספק תובנות לתוך הצינור ניתוח מבנה המאפשר לקורא לבצע מחקר מבנית של אטומי ברזולוציה של אסיפה macromolecular בטכניקות SSNMR.

הפרוטוקול כוללת 3 סעיפים:

1. מוצק NMR לדוגמה ייצור

תנאי לביצוע ניתוח NMR של מצב מוצק, רכיבי חלבון בצורך הרכבה macromolecular לבוא לידי ביטוי, התווית על-ידי איזוטופ, מטוהרים, שהורכבו במבחנה למצב מורכב כמו מקורי (עבור לדוגמה ראה איור 2) . כדי להבטיח רגישות גבוהה NMR, איזוטופ העשרה ¹³C ו ¹⁵N תיוג נדרש באמצעות מדיה ביטוי חיידקי מינימלי בתוספת ¹³C ו ¹⁵N מקורות, כגון בצורה אחידה ¹³ התווית על-ידי C גלוקוז/גליצרול ו ^-15NH₄Cl בהתאמה. בשלב מאוחר יותר של הפרוטוקול, באופן סלקטיבי ¹³התווית על-ידי C דגימות הופק באופן סלקטיבי ¹³מקורות התווית על-ידי C כגון (1, 3 –¹³ג)- ו (2 –¹³C)-גליצרול (או (1 –¹³ג)- ו (2 –¹³ג)- גלוקוז) נעשה שימוש כדי להקל על הניתוח NMR. מעורבות מדגם שכותרתו המתאים תערובת equimolar של 50% ¹⁵N – או 50% ¹³התווית על-ידי ג או 50% (1, 3 –¹³C)-50% (2 –¹³C)-גלוקוז מוצגים כדי לתאר את הגילוי של הבין-מולקולרי אינטראקציות. רמה גבוהה של חלבון טוהר, כמו גם תנאים קפדניים במהלך השלב הרכבה הם גורמי מפתח כדי להבטיח צו מבניים הומוגנית של המדגם הסופי.

2. ראשוני אפיון מבניים בהתבסס על מימדי NMR solid-state (1 ד)

אנו מציגים את הניסויים חיוני עבור ניתוח מבניים על-ידי SSNMR. (1 ד) חד-ממדי קרוס-קיטוב (CP), INEPT / RINEPT²⁸ ניסויים, שאותרו על הגרעינים ¹³C משמשים כדי לזהות מקטעי חלבון גמיש הנוקשה בהרכבה, בהתאמה, הערכת מידת מבנית הומוגניות, פולימורפיזם המקומי (עבור לדוגמה ראה איור 3).

רונג > 3. ניתוח הסתגלותי ותלת מימד מבנה נחישות

סעיפים קטנים 1 ו-2 נוגע הניתוח הסתגלותי, אשר מבוססת על ההקצאה תהודה SSNMR של כל שאריות נוקשה ההרכבה חלבון, כמו המשמרות כימיים הם רגשים רגיש מאוד בסביבה המקומית והוא יכול לשמש כדי לחזות את פי/psi דו-מישור זוויות, ובכך לקבוע את מבנה שניוני. איור 4 מתארת דוגמה הקצאת תהודה רציפים הליבה נוקשה של אסיפה חלבון. קביעת מבנה תלת-ממדי מבוסס על האוסף של נתונים מבניים כגון מרחק ריסון קידוד קרוב proximities (< Å 7-9), המכיל גם אינטרה – וגם מידע הבין-מולקולרי. 3 ו- 4 מתארים איפוק מרוחק לטווח ארוך אוסף ופרשנות. קשרים ארוכי טווח מוגדרים התפלגות ¹³C –¹³C proximities הנובעות שאריות אני כדי ג’יי, עם | i-j | ≥4, הגדרת ובכך הקיפול חלבון שלישוני של יחידת משנה monomeric את, או הבין-מולקולרי ¹³C –¹³C proximities, הגדרת הממשקים הבין-מולקולרי בין החלבוניות בהרכבה. אינטרה – וממשקים הבין-מולקולרי מומחשים באיור5. SSNMR ריסון זוהה עד ¹³C –¹³C ו ¹⁵N –¹³C recoupling ניסויים בדרך כלל לקודד למרחקים internuclear < 1 ננומטר. סעיף קטן 4 מסביר את הגילוי של ריסון המרחק הבין-מולקולרי. בהרכבות חלבון סימטרית, השימוש homogeneously שכותרתו דגימות (כלומר 100% בצורה אחידה, או בצורה סלקטיבית עם התווית) עבור זיהוי האינטראקציות הבין-מולקולרי יחידה משנית-יחידת משנה הוא מוגבל, כמו שני אינטרה – ולא בין – molecular אנשי קשר להוביל הסימנים לזיהוי. גילוי ברורה וחד משמעית של proximities הבין-מולקולרי מושגת באמצעות דגימות שכותרתו מעורבת, המכיל תערובת equimolar של שני מדגמים שכותרתו באופן שונה, בשילוב לפני צבירת. סעיף קטן 5 מציג בקצרה את מבנה דוגמנות.

איור 1 : זרימת העבודה ברזולוציה אטומית המחקר המבני מאת NMR של מצב מוצק. ¹³ ג’, ¹⁵N איזוטופ שכותרתו ייצור החלבון, טיהור יחידה משנית, יחידת משנה הרכבה, שליטה על היווצרות הרכבה, ניסויים SSNMR, SSNMR ניסוי ניתוח והפקת מרחק ריסון, מידול המבנה מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1-solid-state NMR מדגם productiona ייצור אחיד 13 C / 15 התווית על-ידי N החלבוניות שימוש טרי טרנספורמציה, pET24-פפטיד-6his פלסמיד המכיל E. coli BL21 כדוריות (DE3), מסיק מהם מהצלחת אגר מוכן. לחסן תרבות טרום 15 מ”ל של מדיום LB מראש ומחוממת עם המושבה אחד. דגירה ב 37 ° C עם סל”ד 200 רועד בין לילה. להעביר את התרבות מראש לתוך 1 ליטר של התרבות המרכזי של מדיום M9 ומחוממת מראש (ראו קומפוזיציה ב טבלה 1), המכיל נדרש התווית על-ידי איזוטופ הפחמן וחנקן המקורות. הערה: זה יכול להיות בצורה אחידה 13 התווית על-ידי C גלוקוז, באופן סלקטיבי (1 – 13 C)- או (2 – 13 C)-גלוקוז 29 , 30 , 31 או ( 1, 3 – 13 C)- או (2 – 13 C)-הנקרא גליצרול 32 , 33. דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס ולמדוד את יתר 600 ברגע התרבות הופך עכורים. כאשר ה OD 600 הגיעה ערך של 0.8, זירוז ביטוי חלבון עם 0.75 מ מ IPTG עבור 4 h. הערה: התנאים אינדוקציה אופטימלית יכול להשתנות חלבון אחד למשנהו. לשחזר את התאים על ידי צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 6000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס טיהור סקיצה (לא מוצג בפרוטוקול וידאו) Lyse תאים באמצעות טכניקות סטנדרטיים כגון טיפול sonication או ליזוזים ולטהר את יחידת משנה של חלבונים תוך שימוש בטכניקות הוקמה או מותאם חקר חלבונים הרכבה. הערה: החלבון יכול לבוא לידי ביטוי בגופים הכללה, בדוק עבור ההתאמה חלבונים על ידי פירוק התא צנטריפוגה עוקבות. אם החלבון המצוי המשקע עם ההריסות תא, זה שנצבר בגופים הכללה. הביטוי מבחן והטוהר של המדגם חלבון לדוגמה על ידי תקן 12-15% טריס-Tricine מרחביות-דף, ראה איור 2A. אם הטוהר מספיקה, החלבון יכולים להיות מורכבים, אחרת לבצע צעד משלים טיהור. במבחנה הרכבה של חוטים חלבון לבדוק ריכוז חלבון בפתרון מטוהרים. אם החלבון מכיל שאריות סופג, למדוד את הספיגה בספקטרופוטומטר UV-280 ננומטר. להכניס את המאגר טהור ספקטרופוטומטרים כמו כיול ולמדוד את ספיגת חלבונים ואז. לחשב ריכוז חלבון באמצעות המקדם הקליטה של יחידת משנה חלבון עם החוק למברט מותאם: λ = חדוה λ x א x ג; כאן הוא האופטי צפיפות-λ אורך-גל נתון; חדוה הוא מקדם ספיגה ספציפיות; l הוא אורך המסלול אופטי בס”מ; c הוא הריכוז ב- mol/ל’ להתרכז החלבון כדי ריכוז של 1 מ מ ביחידה צנטריפוגלי מסנן. להציג את הדגימה לתוך יחידת צנטריפוגלי מסנן צנטריפוגה ב 4000 x g למשך 30 דקות, מערבבים את הפתרון ב יחידת מסנן בעדינות עם pipet כדי להימנע חלבון התצהיר-המסנן. חזור על הפעולות עד הריכוז הרצויה. הערה: ריכוז מכלול האופטימלי תלוי המערכת וצריך ניתן למטב (בדרך כלל בין 0.1 – 1 מ מ). אם equimolar מעורבב עם תוויות מדגם של שני חלבונים שונים שכותרתו אצוות מוכן (למשל (חצי) (U – 15 N)-/ (U – 13 ג)-עם התווית), ערבוב חייב להתבצע לפני או מיד אחרי השלב ריכוז כדי להבטיח המגון של הפתרון מעורב. להעביר את הדגימה לתוך צינור ואת דגירה זה תחת עצבנות לשבוע אחד בטמפרטורת החדר. בדרך כלל פלמור של subunits לתוך חוטים מלווה את הפתרון הופך עכורים. בדוק את מורפולוגיה מיקרוסקופית fibril ואת ההומוגניות לדוגמה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (הגדלה 6300 X – 45000 X), ראה איור 2B. צנטריפוגה המדגם עבור 1 h 20000 x g ו- 4 ° C. הסר רוב תגובת שיקוע, השאר רק מספיק נוזלים כדי לכסות את המשטח כדי למנוע ייבוש הדגימה. לבדוק את תגובת שיקוע עבור שאינם מורכבים subunits על ספקטרופוטומטרים UV. לשטוף את דוגמה על-ידי הוספת H 2 O זהיר resuspend את התוכן עם פיפטה. לא מערבולת. ספין המדגם למשך 30 דקות-22000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. חזור על השלב כביסה 3 פעמים. בדוק במהלך כל השלבים כביסה אם בגדר שומרת על היבט שלו לאחר צנטריפוגה ולבדוק את תגובת שיקוע עבור שאינם מורכבים subunits על ספקטרופוטומטרים UV. להוסיף אזיד הנתרן 0.02% (w/v) (נאן 3) כדי למנוע זיהום חיידקי ולאחסן את הדגימה עד מידה 4 ° C. Solid-state NMR הרוטור מילוי צנטריפוגה פעמיים במשך 30 דקות-22000-g ו- 4 מעלות צלזיוס. הסר מקסימלי תגובת שיקוע; בעקביות מדגם שנוצר תלוי מכלול חלבון, והוא בדרך כלל דמוי ג’ל הפיקדון. משתמשים pipet נימי להכניס את הדגימה הרוטור SSNMR. הערה: כאן, אנו מציגים את ההליך על הרוטור בקוטר 4 מ מ. צנטריפוגה צנטריפוגה הרוטור על השולחן בעדינות להציג את הדגימה לתוך הרוטור. חזור על התהליך עד הרוטור מלא לגמרי. לשמור רווח מינימלי כדי לסגור את הרוטור עם הכיפה הרוטור. אם הכמות מדגם אינה מספיקה, להציג הוספה זמינים מסחרית כדי למלא את השטח הנותר כדי להבטיח את עניי התפלגות הדגימה הרוטור. הערה: תלוי על מדגם שהורכב בעקביות, שזה יהיה הולם יותר להשתמש במרית דק, במיוחד עבור דגימות צפופה מאוד. לבוש יומיומי עם קטרים של 2.5 עד 4 מ מ משמשים בתדרים MAS בינונית. להוסיף עקבות של חומצה 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) לכיול פנימי כימי shift וטמפרטורה. לסגור את הפקק עם מכשיר הסגירה. בדוק תחת זכוכית מגדלת אם הכובע הוא מוכנס היטב, סגור לגמרי. איור 2: נציג תוצאות עבור חלבון יחידה משנית טיהור והרכבה. א) 15% טריס-tricine מרחביות-דף של יחידת משנה של חלבונים (כולל שלו 6-תג) בשלבים שונים של טיהור. ליין 1 – סמן חלבון משקל מולקולרי; ליין 2 – e. coli BL21 (DE3) תאים שליטה uninduced; ליין 3 – e. coli BL21 (DE3) תאים המושרה עם 0.75 מ מ IPTG; ליין 4 – solubilized גופות הכללה ליין 5 – שברים supernatant תא lysate; ליין 6 – שבר מטוהרים לאחר ניקל ללא יכולת תנועה כרומטוגרפיית זיקה מתכת (IMAC) FPLC ו- desalting. B) מוכתם באופן שלילי הסיבים חלבונים על ידי הדמיה TEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 2. אפיון מבניים ראשוני המבוסס על מימדי NMR solid-state (1 יח) 1 י צלב-קיטוב (CP) הקמה ראשונית להוסיף הרוטור לתוך המגנט NMR להתחיל סיבוב הרוטור בתדר של 5 קילו-הרץ, ולחכות ייצוב של ±10 הרץ, ואז להאיץ עד 7 קילו-הרץ. לכוון ולהתאים 1 H, 13 C ו- 15 N ערוצים. הגדר את הטמפרטורה ל- 2-10 ° C (275-283 K); לדוגמה חימום-7 קילו-הרץ MAS הוא נמוך, התאמת הטמפרטורה אינה בדרך כלל נדרשת בתדר הזה MAS. להקליט פעמו יחיד 1 י 1 H קשת באמצעות סריקות 16. הערה: רמות צריכת חשמל כנראה בעבר מוטבו במתחם הפניה (כגון 13 C / 15 N היסטידין או גליצין), כדי לספק את הערכים ההתחלתיים עבור מיטוב רמות המתח בניסויים על הדגימה היעד; הליך זה הוא פעילות שגרתית, ולכן מתוך טווח של פרוטוקול זה. לשמור על הטמפרטורה במהלך כל ניסויים בין 2-10 ° C, בדגימות hydrated שהטמפרטורה באה לידי ביטוי השינוי היחסי של התהודה 1 H מים בכמות גדולה ביחס האות DSS 34. למדוד את הטמפרטורה בעקבות את היחסים אלפא (H 2 O) = 7.83-T/96.9 עם דיוק של 1-2 ° C 35. סט למעלה הרצוי MAS תדירות והמתן עד ייצוב של ±10 הרץ. הערה: כאן הוכח עבור תדירות של 11 קילו-הרץ- המנגינה התאמה 1 H אנד 13 C ערוצי שוב, להתאים את הטמפרטורה עם העזרה של ניסוי 1 H 1 י. להגדיר 1D 1 H – 13 ג CP 36. הערה: CP ניסויים להראות את הסימנים הנובעים שאריות קונפורמציה נוקשה. הדופק כיול, סופגת פרמטרים ניתן ישירות למטב על הדגימה כאשר הרגישות גבוהה מספיק להתבונן אותות לאחר פחות מ ~ 32 סריקות. הערכים אופטימיזציה הראשונית לקוחים אופטימיזציה רגיל על המתחם הפניה. זמן מגע CP ורמות כוח נבחרים בהתבסס על עוצמת האות מקסימלי. בדגימות חלבון, הזמן קשר אופטימלית CP הוא בדרך כלל בין 200 μs גב’ 2 הפרמטרים סופגת צריך גם להיות מחדש מותאם מ הכיול על המתחם הפניה. בזהירות לצפות הלוקליזציה של ספינינג sidebands בתדר MAS נתון. להקליט אסמכתא 1 י 13 ג CP קשת המשמשת 1 י ספקטרלי טביעות אצבע. פרמטרים טיפוסי הם סריקות 128, ms CP קשר פעם 1, 100 קילו-הרץ סופגת כוח, עיכוב המיחזור של 3 s וטרשת 25 רכישת. כיילו את 1 H ו- 13 C כימי במשמרות בעקבות המלצות סיסטמטי 37. לקבוע את תדירות תהודה של האות H DSS 1 (שינוי כימי של עמודים לדקה 0); 13 משמרות כימית C מוזכרים כדי 1 H משמרות (בדרך כלל ~ 0.25144, נגזר היחס של 13 C ל תדר תהודה 37 1 H). תהליך 1D 1 H – 13 ג CP להתנסות ללא apodization הפונקציה (ראה איור 3A ו- B איתור על אסיפה חלבון homogeneously מסודר). לבחור שיא מבודד כדי להעריך את linewidth במדגם, מעידה על הסדר המבני ועל הומוגניות. Linewidths טיפוסי 13 C עבור הרכבות חלבון ביולוגי מסודר תחת MAS-שדות מגנטיים גבוה בטווח שבין 20-150 הרץ (הנמדדת רוחב המלא בחצי גובה (FWHH)). מעריכים את יחס אות לרעש (S/N) בספקטרום CP- הערה: היחס S/N תלוי בגורמים רבים, כולל בעיקר את כמות הדגימה הרוטור, מידת קשיחות של מבנה החלבון ואת נוכחותם של קונפורמציה מולקולרית יחיד. כלל אצבע, מדגם צריך להיות מתאים ספקטרוסקופיה SSNMR רב-ממדי אם אות הוא ציין בספקטרום אופטימיזציה 1 י 1 H – 13 ג CP הקליט עם סריקות 64. זום לתוך האזור ספקטרלי של החלבון המרכזי (backbone) קרבוניל מגנטיים לשפות אחרות (בעיקר) בין 165-180 עמודים לדקה. מעריכים את התוכן מבנה שניוני באסיפה במעמד מגנטיים קרבוניל עמוד השדרה של חלבון עם מגנטיים של שאריות בα-הסליל או β-strand קונפורמציה העביר לעומק המגרש או להתקפה, בהתאמה (ראה איור 3B עבור יחידת משנה בעיקר α-הסליל) 38. ניסוי 1 י INEPT להגדיר 1 י 1 H – 13 ניסוי ובדיקת חומר C כדי לחקור חלקים ניידים במיוחד (sub-µs) מכלול חלבון. הערה: גארפ סופגת של כמה קילו-הרץ במהלך רכישת 39 הוא נפוץ, כדי לאפשר עיכובים interscan קצרים (בדרך כלל 1 s) ללא פגיעה החללית. להקליט קשת מיומן הפניה זה משמש טביעות אצבע עבור מקטעי חלבון נייד; פרמטרים טיפוסי סריקות 128 הינם מועד הרכישה של גב’ 25 תהליך 1 H – 13 C מיומן הניסוי. הכמות והמיקום של האותות מעידים על כמות משקעים נייד ואת ההרכב חומצת אמינו בהתאמה. הערה: גם להקליט 2D 1 H – 13 ניסוי ובדיקת חומר C אם אותות קיימים בספקטרום מיומן 1 י (לקבלת דוגמה, ראה איור 3C) כדי לאפשר זיהוי ספציפי יותר של חומצה אמינית. במקרים הקצאה חד משמעיים, אנו ממליצים לבדוק את עמדות אות של רכיב מאגר על-ידי פתרון NMR. להשתמש את מסד הנתונים של BMRB 40 ופורסמו נתוני 38 כדי להקצות את מגנטיים חומצת אמינו המתאימה שלהם ב יד סליל אקראי קונפורמציה; הספקטרום מכיל מאגר ניידים רכיבי בלבד, אם אין שאריות נמצאים במשטר ניידים מאוד. איור 3: תוצאות נציג SSNMR ספקטרה רכישה עבור אסיפה חלבון בנוי היטב. A) 13 C מזוהה FID של ניסוי cross-קיטוב 13 C H – 1. B) 1 H – 13 C קרוס-קיטוב הניסוי. C) 1 H – 13 C מיומן ניסוי של אסיפה חלבונים נוקשה; רק מאגר הרכיבים גלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 3. ניתוח הסתגלותי ותלת מימד מבנה נחישות תהודה רציפים הקצאה להגדיר 2D 13 C – 13 C ספין פרוטונים דיפוזיה (PDSD) 41 הניסוי כדי לאתר אינטרה-שאריות 13 C – 13 C מתאמים, כולל רשתות בצד. להשתלט על הערכים עבור השלב הראשוני 1 H – קרוס-קיטוב 13 C מ ה 1 D 1 H – 13 ג CP הניסוי. להגדיר הזמן ערבוב 50 מילישניות עבור בצורה אחידה 13 דגימות התווית על-ידי C וכדי ms 100 עבור באופן סלקטיבי 13 דגימות התווית על-ידי ג. לקבוע את הזמן רכישה עקיף בין 5-25 ms רכישה ישירה בין 15-25 ms תלויים הרזולוציה ספקטרלי מהותי, אשר יכול להיות מוערך ע י האות גלוי באורך דעיכה אינדוקציה חינם (FID) (שהודגם ב איור 3 א). לבדוק מספר פרמטרים עיבוד כדי לחפש את הערכים אופטימלי ביחס אות לרעש והרזולוציה בספקטרום, בדרך כלל עיבוד נאותה יכולה להיות מושגת באמצעות פונקציה חלון qsine עם משמרת בל סינוס (חלטורה) של 2.5-4- להגדיר, שיא ותהליך 2D 13 C – 13 C PDSD עם ניסוי זמן ערבוב ביניים כדי לזהות רציף 13 C – 13 C מתאמים לחיבור בעיקר אני – i±1, אבל גם i±2 ו- i±3 . שאריות, בהתאם קשיחות המרכזי (backbone) חלבון ורכיבי מבנה שניוני. יש להגדיר את הזמן ערבוב בין 100-200 ms עבור דגימות שכותרתו בצורה אחידה. כל הערכים האחרים ניתן לקחת מ קצר ערבוב זמן 2D 13 C – 13 ג PDSD. להגדיר, שיא ותהליך 2D 15 N – 13 ג N אני CA . אני בעלת N אני CO אני ניסויים באמצעות 1 H – CP 15 N ו- CP 15 N – 13 C העברה ספציפי 42. למטב את 13 C 15 N – קיטוב העברת אופנה 1 D ישירות על הדגימה של עניין, בהתבסס על עוצמה מירבית באזור CA או קרבוניל, בהתאמה. משחק פאזל הקלדהקאל ערכים עבור הזמן אנשי קשר ספציפיים CP הם בין 2-6. גברת להגדיר, שיא ותהליך סדרה של 2D 15 N-(13) C – 13 C ניסויים לצורך הקצאה. הערה: הראשון 15 N – 13 C קיטוב העברת ערך הפרמטר יכול להתבצע N אני CA אני / N אני CO אני ניסויים. אינטרה-שאריות מתאמים הוקם מתוך N אני (CA אני) CB אני ו N אני (CA אני) CO אני, באמצעות בהתאמה לחלום 43 ו PDSD 13 C – 13 C קיטוב העברות. שאריות (i) שאריות קישוריות רציפים (i-1), מתקבל מפולי N אני (CO i-1) CA i-1 ו- N אני (CO i-1) CX i-1 הניסויים, הן באמצעות PDSD 13 C – 13 C קיטוב העברה. בחר NMR תוכנית ניתוח כגון ניתוח CcpNmr 44 או ספארקי 45 לטעון הספקטרום של 2D לתוך התוכנה (ביטוי עם ניתוח CcpNmr) ולטעון את רצף החלבון העיקרי. להתחיל עם הזיהוי של סוגי חומצת אמינו גלוי ערבוב קצר 13 C – 13 C PDSD הספקטרום. לחבר את אטומי הפחמן של מערכות ספין כדי לאפשר " שאריות-סוג " הקצאה מסוימת; ראה איור 4A עבור ההקצאה של משקע תראונין. לזהות משקעים רבים ככל האפשר; זה יהיה תלוי את גודל יחידת משנה של חלבון, רזולוציה ספקטרלי נפיצה. כיסוי הקצר-ערבוב עם ערבוב בינונית 13 C – 13 C PDSD הספקטרום. הערה: הפסגות משלים גלוי PDSD ללישת ביניים נובעים בעיקר רציפים (שאריות של אני – שאריות i±1) אנשי קשר. דוגמה למשימה רציפים 2-שאריות מאויר באיורים 4B איור. לסמן את הפסגות תהודה של מערכת סחרור, למצוא מתאמים PDSD ערבוב בינונית עם תדירויות תהודה של מערכות אחרות ספין. חלבונים קטנים או פפטידים, זה יכול להיות אפשרי להשיג את המשימה כולה תהודה רציפים המבוססת על דו-מימדית 13 C – 13 C PDSD ניסויים. הערה: בβ-strand מבנה שניוני מוטיבים שאריות i – שאריות i±2 13 C – 13 C הקשר עלול להראות אותות חזק יותר מאשר אנשי קשר רציף בשל סמיכותם בחלל; בα-הסליל מבנה שניוני מוטיבים שאריות i – שאריות i±3 13 C – 13 C הקשר יכול להוביל גם לאותות אינטנסיבי. אם ערבוב בינונית PDSD ניסויים באופן סלקטיבי 13 דגימות התווית על-ידי C זמינים, כיסוי אותם על גבי הקשת ערבוב קצר (אם זמין על באופן סלקטיבי 13 לדוגמה התווית על-ידי C) ולהקצות את משלימה פסגות, לוקח בחשבון תיוג סלקטיבי 13 ג דפוס (1, 3 – 13 C ו- 2 – 13 C גליצרול 32 , 33 או 1 – 13 C ו 2 13 ג גלוקוז 29 , 30 , 31. הערה: לדוגמה, ב 2 – 13 C גליצרול תווית לדוגמה מספר סוגים של חומצת אמינו מסומנות על העמדה Cα ללא ההעתק סמוכים (Cβ ו- C ') הנקרא, ולכן להעדיף את Cα-Cα העברה בין שאריות סמוכים. בדגימות באופן סלקטיבי שכותרתו, ארוכי טווח 13 C – 13 C מתאמים אולי לבנות כבר ללישת ביניים 13 C – 13 C PDSD ניסויים. אם לשיא לא יכולה להיות מוסברת על ידי מתאם סדרתי, זה יכולים לנבוע איש קשר לטווח ארוך. עבור הורה מאוד הומוגנית יחידה משנית מבנים בהרכבה macromolecular, סט אחד של ושעמומו צפוי להיות גלוי הספקטרום. אם הכפיל את עצמו (או יותר כפול) מגנטיים גלויים עבור 13 C אטומים או חלבון עמוד השדרה נמתח, הייצורים החיים שני (או יותר) האטום או סיום רצף העיקרי בהרכבה, בהתאמה, קיים. השתמש הקשת NCA 2D המכיל אינטרה-שאריות 15 N – 13 Cα מתאמים כדי לזהות את תדירויות תהודה 15 N עבור כל שאריות. אם הרזולוציה בממד 13 C אינה מספיקה, השתמש במידע משלים על התהודה Cβ NCACB 2D כדי לזהות את תדר תהודה אינטרה-שאריות 15 N. השתמש 2D NCACB ספקטרה NCACO המכיל אינטרה-שאריות 15 N – 13 C – 13 C מתאמים (i) לזהות את תדירות 15 N אינטרה-שאריות ו (ii) כדי לפתור אי בהירות 13 C – 13 C PDSD עם העזרה של הממד נוספים 15 N. ההיפוך של האות עקב ההעברה החלום מוביל ההתבוננות טיפוסי מתאמים Cα-Cβ אשר האות Cα הוא חיובי, האות Cβ שלילי. עוד צד-שרשרת 13 C, אם גלוי הספקטרום, הן חיוביות שוב. איור 4: 2-ממדי 13 C – 13 C SSNMR PDSD ניסויים מאוד מסודר, בצורה אחידה 13 ג, 15 חלבון התווית על-ידי N הרכבה. א) קצר ערבוב זמן PDSD (ms 50 ערבוב). B) הקצאה של רצועת 2-שאריות Ile32 – Thr33 באמצעות הכיסוי של הזמן ערבוב קצר PDSD עם זמן ארוך ערבוב PDSD (200 ms ערבוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. מבנה שניוני נחישות להשתמש 13 Cα, 13 Cβ ערכים כימיים shift כדי לחשב את הכימיקל משני משמרת 46 ΔδCα-ΔδCβ , הרומז על מצבה העגום של המבנה משני. לחשב 13 – 13 Cα (סליל אקראיים), 13 Cβ(assigned) – Cα(assigned) 13 Cβ (סליל אקראיים). הערה: ניתן להשיג שינוי כימי ערכי עבור שאריות קונפורמציה סליל אקראי מ 38. מגרש ΔδCα-ΔδCβ, חיובית או שלילית ערכים עבור > שאריות 3 ברציפות מציינים β-strand או קונפורמציה α-הסליל בהתאמה; משקעים גליצין, פרולין עשוי להציג ערכים shift כימי לא רגיל, כמו לעיתים קרובות הם פועלים " מבנה שניוני שוברי ". לחזות את זוויות דו-מישור חלבון מ המשמרות כימי שהוקצו באמצעות 47 , TALOS + 48 או 49 , PREDITOR 50. זוויות דו-מישור החזוי פי/Psi לשקף את מבנה שניוני של subu חלבוןניט ומשמשים ריסון מבניים כמו לאורך כל התהליך מידול. אוסף של ריסון מבנית להגדיר למעלה והקלטה של 2D 13 C – 13 C PDSD הניסוי עם זמן ארוך ערבוב לזהות ארוכי טווח 13 C – 13 C מתאמים. ערבוב טיפוסי פעמים נע בין 400 ms 1 ס להשתמש באופן סלקטיבי דגימות התווית על-ידי C 13, כפי דילול ספין משפר באופן משמעותי את העברת קיטוב בין פחמנים רחוקים. כיסוי ללישת ארוך 2D 13 C – 13 C PDSD הקליט על מדגם שכותרתו באופן סלקטיבי על גבי ללישת ביניים 13 C – 13 C PDSD, הוקלט במידת האפשר על המדגם באופן סלקטיבי שכותרתו זהה. פסגות משלימה נובעים מתאמים בין אטומים 13 C רחוקים יותר. במהלך המשימה תהודה, לקחת בחשבון את ערכת תיוג סלקטיבית. להעריך בזהירות את הרזולוציה של הספקטרום להגדרת המשימה סובלנות חלון, קרי תלויים הרזולוציה ספקטרלי מגנטיים בטווח מסוים ppm שזה יכול לתרום האות. סטיית התקן של דיוק ההקצאה מחושבת באופן אוטומטי בתוכניות הקצאה NMR, כגון ניתוח CcpNmr או ספארקי. אם אות יכולה להיות מוסברת על ידי סדרתי (שאריות של אני – שאריות i±1) או איש קשר לטווח בינוני 13 C – 13 C (שאריות-שאריות אני ± 2, 3 או 4), לשמור על המשימה הזאת מאז קיטוב אוביקטיביות ההעברה יכול להסביר המתאם גם אם המרחק 13 C 13 C – הוא מעל לטווח קשר גלוי הצפוי. לסווג את ההקצאות אנשי הקשר ארוכי טווח 13 C – 13 C לאותות ברורה וחד משמעית של תדר. במקרה של תדירות הקצאות ברורה וחד משמעית, תהודה אחד בלבד הקצאה אפשרית ביחס לחלון סובלנות הקצאה. הערה: הקצאות רב-משמעי להכיל כל ההקצאות תהודה אפשרי בתוך חלון סובלנות. אי בהירות ניתן להעלות בו זמנית במהלך החישוב מבנה על ידי סיבובים איטרטיביים של פירושונים בהתבסס על מבנים ראשוני מחושב באמצעות רק הרצועות ברורה וחד משמעית, כפי שבוצע שגרות חישובית כמו אריה 51 או UNIO 52. יתר על כן, מבני נתונים ממקורות biophysical שונים (למשל מוטציה או תיחתך מבנה יחידת משנה על-ידי פתרון NMR או קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, מסה-לכל-אורך מדידות, הקפאה-EM מפה) יכול לשמש גם כדי להפחית את רמת העמימות, עבור דוגמאות לראות 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58. זיהוי של המרחק הבין-מולקולרי ריסון בהרכבה חלבון סימטרית להגדיר 2D 15 N – 13 C כאב-CP 59 ניסוי מעורב (חצי) U – 15 N – / U – 13 התווית על-ידי C לדוגמה. אותות זוהה מספקטרום כאב-CP צריך לנבוע הבין-מולקולרי 15 N – 13 C proximities. להשתמש את מגנטיים שהוקצו בעבר כדי לבצע את המשימה של אנשי הקשר הבין-מולקולרי. להגדיר 2D 13 C – 13 C PDSD עם זמן ארוך ערבוב (> 600 ms) ב (חצי) מעורבת (1, 3 – 13 C)-/ (2 – 13 C)-גליצרול או (1 – 13 C)-/ (2 – 13 C)-דוגמת גלוקוזה. הערה: אותות זוהה זה ספקטרום 13 C 13 C – נובעים המולקולריים הבין-מולקולרי אינטרה-13 C – 13 C proximities. עם זאת, משלימים את החסר גבוהה של שתי ערכות תיוג מאפשר תהודה מסוים זוגות חד משמעית נובעים הקשר הבין-מולקולרי, למשל סרין CA ב (2 – 13 C)-גלוקוז שכותרתו subunits הקשורות במשדרים סרין ב (1 – 13 C)-גלוקוז שכותרתו subunits. דוגמאות שכבת-על הספקטרום של המדגם מעורב כדי ספקטרום 13 C 2D 13 C – הוקלט על homogeneously הנקרא ((1,3-13C) – ו (2 – 13 C)-גליצרול או (1 – 13 ג)- ו (2 – 13 C)-גלוקוז מתויג דגימות). סימנים נוספים בספקטרום הקליט על הדגימה מעורב צריכה לנבוע האינטראקציות הבין-מולקולריות. מבנה מידול נתונים SSNMR להכין את הרשימות איפוק SSNMR לצורך חישוב מבנה: רצף חלבונים (1); (2) התוך מולקולרית מרחק ברורה וחד משמעית ריסון; (3) ריסון התוך מולקולרית מרחק רב משמעי; (4) זווית דו-מישור TALOS המבוסס על ריסון; (5) הבין-מולקולרי מרחק ברורה וחד משמעית ריסון; (6) ריסון הבין-מולקולרי מרחק רב משמעי; (7) נתונים נוספים טכניקות biophysical אחרות (למשל סימטריה בנפח גדול לכל אורך, פרמטרים). הדעת מספר לספק תובנות מידול המבנה מבוסס על נתונים SSNMR, יחד עם נתונים מבניים משלימים 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 הערה כי האיפוק מרחק רב משמעי יכול להיות יחודיות במהלך חישוב מבנה ביחס המקדים מודלים מבניים בהתבסס על ריסון מרחק ברורה וחד משמעית. כדי להבטיח דיוק מבנה, בזהירות לצפות אם המבנה יתמקד קיפול יחיד. איור 5 : “אינטרה” – והוא הבין-מולקולרי אנשי קשר בחלבון סימטרי הרכבות. ייצוג סכמטי של אינטרה – לעומת הבין-מולקולרי 13 C – 13 C קשרים ארוכי טווח בהרכבה macromolecular לוליינית. Subunits צבועים לבן ואדום להמחשת תיוג מעורבות של subunits; דהיינו לפני ההרכבה בוצעה תערובת 1:1 של שתי ערכות תיוג שונים (1 – למשל הגלוקוז 13 C ו- 1 – 13 ג גלוקוז). A) התפלגות 13 C – 13 C קשרים ארוכי טווח (חץ מקווקו כחול); ב’) הבין-מולקולרי 13 C – 13 C קשרים ארוכי טווח (אדום מקווקו חצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Representative Results

זרימת העבודה SSNMR טיפוסית כוללת מספר שלבים מאויר באיור1. בדרך כלל החלבוניות המיוצר על ידי במבחנה heterologous ביטוי ב e. coli, מטוהרים, התאספו תחת רועד אך לפעמים גם בתנאים סטטי. הביטוי ולטיהור יחידת משנה של חלבונים, מלוות מרחביות ג’ל כרומטוגרפיה (איור 2 א). היווצרות של הרכבות macromolecular ואז יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) (ראה איור 2B לקבלת דוגמה של אסיפה filamentous). לאחר הקדמה של ההרכבה החלבון לתוך הרוטור SSNMR, הרוטור מוכנס לתוך ספקטרומטר, תדירות MAS וטמפרטורה מוסדרים, הספקטרום נרשמים. תובנות הראשון ניתן להשיג על ידי טכניקות SSNMR 1 י. איור 3 מראה FID SSNMR טיפוסי זוהה בערוץ 13C על מדגם הומוגני מבחינה מבנית חלבון, 1H -13ג CP קשת, חושף את מגנטיים13C נוכח הגרעין נוקשה של יחידת משנה של חלבונים ב- הרכבה, 2D 1H -13C מיומן קשת, המייצג את שאריות ניידים. בשביל אטומי תובנות הליבה נוקשה של מבנה ההרכבה, ניסויים SSNMR רב-ממדי צריך להיות מוקלטת על בצורה אחידה, באופן סלקטיבי שכותרתו דגימות כדי להקצות תחילה את ושעמומו SSNMR, ואז לזהות proximities ארוכי טווח (ראה איור 4 ). הספקטרום מעובדים נותחו בתוכנת נאותה כדי להקצות את ושעמומו SSNMR ואת תמצית אינטרה – ואת המרחק הבין-מולקולרי ריסון (איור 5). הרצועות מרחק SSNMR משמשים גם לבד או בשילוב עם נתונים שיטות משלימות, אשר ניתן לשלב את הסימולטור. עבור נציג הבראבה מכלולים macromolecular נפתרה על-ידי SSNMR טכניקות איור 6 מדגים מספר הרכבות filamentous תוספות חיידקי, הסיבים עמילואיד. איור 6:Filamentous מבנים macromolecular נקבע על ידי בגישה NMR של מצב מוצק: חוטים חיידקי, הסיבים חלבון עמילואיד. A) pilus סוג 1 של uropathogenic e. coli, PDB קוד 2N7H 4; B) עולה נימה, PDB קוד 2N1F 63; C) סוג III הפרשת מערכת מחטים, PDB קודים 2MME, 2LPZ ו- 2MEX 2,3,64; D) בטא עמילואיד AB42 הסיבים, PDB קוד 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 , אוסקה מוטציה PDB קוד 2MVX 57, איווה מוטציה PDB קוד 2MPZ 58; E) הסיבים אלפא-synuclein, 2N0A קוד PDB 68; F) תחום פריון הט-s, PDB קוד 2RNM, 2KJ3 69,70. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

NMR solid-state (SSNMR) היא שיטה של בחירה עבור אפיון חלבון macromolecular מכלולים ברמה האטומית. אחד הנושאים המרכזיים בקביעת מבנה המבוסס על SSNMR היא איכות ספקטרלי של המערכת ובדוקים, המאפשר הקמת תלת-ממד מודלים מבניים של דיוק שונים, החל בדרך כלל מודלים ברזולוציה נמוכה (המכיל המשני מבנה קטן נתוני תלת-ממד ורכיבי) כדי מדומים הבראבה תלת-ממד. כמות ואיכות המידע המבני המופק ניסויים SSNMR רב ממדית היא המפתח לחישוב מבנה NMR ברזולוציה גבוהה של ההרכבה.

הפרוטוקול המתואר מסתמך על הגילוי של ¹³C –¹³C ו ¹⁵N –¹³C מבניים ריסון הדורשים את ההקלטה של מספר ספקטרה 2D (וגם לפעמים 3D) עם גבוהה אות לרעש. בתדרים MAS מתונה (< 25 קילו-הרץ), המדגם מוחדרים הרוטורים עם גדלים מקוטר 3.2-4 מ מ ומאפשר חלבון בכמויות של עד ~ 50 מ”ג, תלויים הידרציה מדגם. כמות הדגימה בתוך הרוטור היא ביחס ישר את יחס אות לרעש ספקטרה SSNMR, גורם מכריע עבור הגילוי של ריסון ארוכי טווח מרחק והקצאה ברורה וחד משמעית שלהם.

הרזולוציה ספקטרלי הוא פרמטר קריטי במהלך ההקצאה תהודה רציפים ואת האוסף ריסון. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, הפרמטרים הכנת המדגם צריך להיות מותאם במיוחד, בפרט הטיהור של יחידת משנה את ואת התנאים הרכבה (pH, מאגר, רועדת, טמפרטורה וכדומה). למיטוב לדוגמה, מומלץ להכין דוגמאות ללא תווית עבור מספר תנאים ברורים אשר נצפתה הרכבה, וכדי להקליט 1D ¹H –¹³ג CP קשת (שמתואר בשלב 2.1) על כל מדגם מוכן. הספקטרום לשרת השווה רזולוציה ספקטרלי ואת פיזור בין ההכנות שונה, המבוססת על אשר ניתן לקבוע את התנאים אופטימליים.

איכות הנתונים SSNMR תלוי בחום על בחירת הפרמטרים רכישה NMR, במיוחד עבור השלבים העברה קיטוב. השימוש של עוצמות שדה מגנטי גבוה (≥600 מגה-הרץ ¹H תדירות) חיוני עבור רגישות גבוהה ורזולוציה ספקטרלי, נדרש כאשר מול יעדים מורכבים כגון חלבון macromolecular הרכבות.

גורם מגביל במקרים רבים הוא הזמינות ספקטרומטר. לכן, בחירה הביוספירה הדגימות כדי להיות מוכנים צריך להקדים את ההפעלה ספקטרומטר. בכל מקרה, בצורה אחידה ¹³C ¹⁵מדגם התווית על-ידי N הוא תנאי הכרחי לביצוע המשימה תהודה רציפות ואף התוך שיורית. חלבונים שהוקצה על-ידי טכניקות NMR של מצב מוצק ראה⁷¹. מכשור לקביעת קשיות ומבנה macromolecular להרכבות בתדרים MAS מתון מחייבת באופן סלקטיבי דגימות התווית על-ידי ג ¹³; עבור זיהוי ארוכי טווח ¹³C –¹³C ו- ¹³C –¹⁵N יוצר קשר הדגימות מבוסס על 1, 3 –¹³C – ו 2 –¹³C-gylcerol או 1 –¹³ג – ו 2 –¹³C-גלוקוז תיוג? נפוץ, כמתואר לעיל. הבחירה בין שתי הערכות תיוג מבוסס על יחס אות לרעש ספקטרלי והרזולוציה. כדי להבחין בין אינטרה – ואנשי קשר ארוך הטווח הבין-מולקולרי, מעורבות דגימות שכותרתו מדולל נחשפו יעיל.

בקיצור, השלבים הקריטיים למחקר מבנית SSNMR אטומי הם: (א) הכנת את subunits והצורך הרכבה ניתן למטב כדי להשיג דגימה מעולה ובאיכות, (ii) ספקטרומטר שדה כוח ורכישה פרמטרים צריכים להיות נבחרו בקפידה; (iii) אסטרטגיות תיוג סלקטיבית נדרשים עבור החלטה במבנה התלת-ממדי, כמות הנתונים הנדרשת תלויה איכות הנתונים ואת הזמינות של נתונים משלימים.

למרות את תחולתן למגוון רחב של מערכות סופרא מולקולרית ועד קרום חלבונים homomultimeric ננו-אובייקטים, SSNMR לעיתים קרובות מוגבל על ידי הצורך mg-כמויות של חומר isotopically עם תוויות. ההתפתחויות הטכנולוגיות ב- SSNMR MAS (≥100 kHz) אולטרה מהיר פתוח במעלה השדרה ¹H מזוהה NMR, רודיש המגבלה של כמות מינימלית מדגם / sub-mg- ⁷²^,–⁷³^,–⁷⁴. למרות זאת, ללימודי מבני נתונים היסטוריים הם דוגמאות התווית על-ידי C ¹³הכרחי, אשר מגביל את היישום של SSNMR דגימות נאסף במבחנה או מערכות לידי ביטוי המיקרואורגניזמים לשרוד על בינונית מזערי שם בתא SSNMR היא שיטה המתעוררים (עבור הדעת ראו ⁷⁵^,⁷⁶^,⁷⁷^,⁷⁸).

גורם חשוב ביישום SSNMR להשיג מבנים תלת-ממד ברזולוציה גבוהה הוא הרזולוציה ספקטראליים: מהותי הטרוגניות הסתגלותי בהרכבה יכול להגביל את הרזולוציה ספקטרלי וניתוח ספקטרום. שאריות תיוג ספציפית ¹³C עשוי במקרים מסוימים לספק אלטרנטיבה לקבל מידע מרחק מסוים על שאריות אסטרטגי על מנת לקבל מודלים מבניים (עבור האחרונות דוגמאות ראה ⁷⁹^,⁸⁰).

SSNMR לקביעת במבנה התלת-ממדי עדיין דורש האוסף של מספר datasets עם נתונים לעתים קרובות רב פעמים אוסף על מכשירים מתוחכמים, בהתאם את הגישה ואת המערכת מספר ימים עד שבועות ב 600-1000 MHz (תדירות¹H) ספקטרומטר. לכן, הגישה ספקטרומטר הזמן יכול להיות גורם מגביל בכל מחקר מעמיק SSNMR.

במקרה של מכלולים חלבון homomultimeric, המוביל SSNMR נתונים באיכות מספיקה כדי לזהות מספר גבוה של ריסון מבניים כגון ³^,⁵⁷^,⁶⁴^,⁷⁰, SSNMR עדיין נותן אין גישה לממדים מיקרוסקופיים. לכן, בקביעת דה נובו SSNMR מבנה אסיפה homomultimeric, אותם או מסה לכל-(הזט ב) נתונים באורך אידיאלי משלימים SSNMR נתונים כדי להפיק את הפרמטרים סימטריה. SSNMR הנתונים לבד לספק את אטומי אינטרה – ממשקים הבין-מולקולרי

SSNMR משלימה ביותר עם טכניקות מבניים כגון EM או הזט ב מדידות, אבל הנתונים באופן מושלם גם יכול להיות משולב עם הבראבה מתקבל על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או NMR פתרון על מוטציה או חתוכים subunits. מספר גדל והולך של מחקרים ניתן למצוא בספרות שבו אפשרה המפגש של נתונים מבניים שונים לקביעת אטומי דגמי תלת-ממד מכלולים macromolecular (ראה איור 6 דוגמאות מיצגות).

בתחום הביולוגיה המבנית, SSNMR מתגלה טכניקה מבטיח ללמודהרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי-אטומית רמה, קרי מתן מבני הנתונים את המשקל האטומי. במובן זה, SSNMR הוא התליון פתרון NMR, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עבור הרכבות מולקולרית, כולל ממברנה חלבונים בהרכבות שלהם ילידי הסביבה וחלבון כגון מעטפות ויראלי, חיידקי חוטים או amyloids, כמו גם RNA ו- מתחמי RNA-חלבון (ראה לדוגמה⁸¹). שלה יישומים רב תכליתי במבחנה בהקשר הסלולר, כגון מעקב אחר שינויים מבניים המשני, שלישוני, רבעוני, לזהות משטחים אינטראקציה עם השותף מולקולות על המשקל האטומי (לדוגמה ⁸²), מיפוי דינמיקה מולקולרית בהקשר של קומפלקסים מורכבים, ציין את הפוטנציאל החשוב של SSNMR במחקרים מבניים עתידיים על מכלולים מורכבים למערכות ביולוגיות.

רכיב	M9 בינוני
NaCl	0.5 g/L
₂פו ח’₄	3 g/L
נה₂HPO₄	6.7 g/L
MgSO₄	1 מ מ
ZnCl₂	10 ΜM
FeCl₃	1 ΜM
CaCl₂	100 ΜM
תערובת ויטמינים MEM 100 X	10 מ ל/L
¹³ C-גלוקוז	2 g/L
¹⁵ מלון NH₄קלרנית	1 g/L

טבלה 1: ההרכב של בינוני ביטוי מינימלית של חלבון רקומביננטי ייצור E. coli תאים BL21.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו ממומנת על ידי ANR (13-PDOC-0017-01 ועד B.H. ANR-14-CE09-0020-01 ל א. ל), “השקעות לעתיד” תוכנית IdEx בורדו/CNRS (PEPS 2016 ל B.H.) הפניה ANR-10-IDEX-03-02 כדי B.H., שופכים Fondation la Recherche Médicale ( AJE20140630090 לא. ל), עקרות, התוכנית האיחוד FP7 (האיחוד FP7-אנשים-2013-סיגריה על א. ל) ואת אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות התוכנית (ERC החל גרנט על א. ל., ההסכם לא 639020) ופרוייקט ” WEAKINTERACT.”

Materials

Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla)	Bruker	–
triple resonance MAS SSNMR probehead	Bruker	–
SSNMR rotors 4mm	Bruker	K1910
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer	Dutscher	28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L	Dutscher	228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker	Dutscher	78376
Tube Revolver Agitator	Dutscher	79547
sonopuls HD 3100	Bandelin	3680
MicroPulser electroporator	Biorad	165-2100
mini-PROTEAN tetra cell system	Biorad	165-8000
AKTA pure system	GE Healthcare	29-0182-24
capillary microman M25 pipet	Gilson	F148502
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
amicon^R ultra-15	sigma	Z740199-8EA
capillaries and pistons	Gilson	F148112
spatula	Fisher	13263799
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
D-glucose ¹³C₆	Sigma	389374
Ammonium-15N-chloride	Sigma	299251
1,3 ¹³C₂ glycerol	Sigma	492639
2 ¹³C glycerol	Sigma	489484
Kanamycin	Sigma	K1876
Carbenicillin	Sigma	C3416
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S7907
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655
Sodium chloride	Sigma	71380
calcium chloride	Sigma	C1016
Magnesium sulfate	Sigma	208094
Iron Chloride	Sigma	157740
Zinc chloride	Sigma	793523
MEM Vitamin Solution (100×)	Sigma	M68954
IPTG	Fisher	BP1755
Trizma base	Sigma	T1503
Tricine	Sigma	T0377
SDS	Sigma	436143
sodium azide	sigma	71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid	Sigma	178837
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
Unicorn 6.3	GE Healthcare		Akta systems
ccpNMR	CCPN		spectrometer systems

References

Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059 (2015).
Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from ‘misfolded’ proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. . Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , (1996).
Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
. Sparky – NMR Assignment and Integration Software Available from: https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017)
Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer’s beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer’s disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Automatically Generated