Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1
Summary
КРИСПР-ассоциированный протеин Cpf1 может управляться специально разработанной РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК на желаемых участках, создавая липкие концы. Основываясь на этой характеристике, был установлен стандарт сборки ДНК (C-Brick), и здесь описывается протокол, подробно описывающий его использование.
Abstract
CRISPR-ассоциированный белок Cpf1 расщепляет двухцепочечную ДНК под руководством РНК CRISPR (crRNA), образуя липкие концы. Из-за этой характеристики Cpf1 использовался для установления стандарта сборки ДНК под названием C-Brick, который имеет преимущество в длинных местах распознавания и коротких рубцах. На стандартном векторе C-Brick существует четыре сайта распознавания Cpf1 – префикс (сайты T1 и T2) и суффикс (сайты T3 и T4) – фланкирующие части биологической ДНК. Расщепление сайтов T2 и T3 дает дополнительные липкие концы, которые позволяют собирать части ДНК с участками T2 и T3. Между тем короткий шов «GGATCC» образуется между частями после сборки. Поскольку новообразованная плазмида снова содержит четыре сайта расщепления Cpf1, этот метод позволяет итеративно собирать части ДНК, которые аналогичны тем, что указаны в стандартах BioBrick и BglBrick. Процедура, описывающая использование стандарта C-Brick для сборки частей ДНКОписывается здесь. Стандарт C-Brick может широко использоваться учеными, аспирантами и студентами и даже любителями.
Introduction
Стандартизация биологических частей ДНК важна для развития синтетической биологии 1 . Разработка процедуры сборки ДНК может заменить специальные экспериментальные проекты и устранить многие неожиданные результаты, возникающие при сборке генетических компонентов в более крупные системы. Стандарт BioBrick (BBF RFC 10) был одним из самых ранних предложенных стандартов сборки ДНК. Он использует префиксную последовательность (содержащую сайты резания EcoRI и XbaI) и последовательность суффикса (содержащую сайты репликации SpeI и PstI) 2 , 3 . Поскольку XbaI и SpeI имеют комплементарные когезионные концы, части ДНК BioBrick, которые разрезаны XbaI и SpeI, могут быть объединены вместе, создавая новый BioBrick для дальнейшей итеративной сборки.
Некоторые дефекты были идентифицированы с использованием стандарта BioBrick 4 . Например, он производит шрам на 8 п.о.Между частями ДНК, что не позволяет создавать белки-слитые. Кроме того, четыре вышеупомянутых типа рестрикционных сайтов с 6 п.о. должны быть удалены из частей ДНК, что очень неудобно. Стандарт BglBrick был создан для решения первой проблемы 5 . Он создает шрам «GGATCT» 6 б.п., продуцирующий Gly-Ser и позволяющий слияние нескольких белков или доменов белка. IBrick был разработан для решения второй проблемы 6 . Он использует самонастраивающиеся эндонуклеазы (HE), которые распознают длинные последовательности ДНК. Поскольку сайты узнавания HE редко существуют в естественных последовательностях ДНК, стандарт iBrick можно использовать для прямой конструирования частей iBrick без изменения их последовательностей ДНК. Тем не менее, стандарт iBrick оставляет шрам 21 п.о. между частями ДНК, что может быть причиной его непопулярности.
В последние годы кластеры регулярно пересекали короткие палиндромные повторы (CRISPR) система быстро развивалась 7,8 . Среди CRISPR-ассоциированных (Cas) белков в настоящее время широко используется эндонуклеаза Cas9 от Streptococcus pyogenes . В основном он вводит двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) с тупыми концами 9 .
В 2015 году Чжан и его коллеги впервые описали Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1). Он относится к системе типа К CRISPR-Cas класса 2 и представляет собой CRISRP-РНК (crRNA) -направленную эндонуклеазу 10 . В отличие от Cas9, Cpf1 вводит DSB с 4 или 5-дюймовым 5-дюймовым выступом 10 . Основываясь на этой характеристике, Cpf1 использовался для разработки стандарта сборки ДНК C-Brick 4 . На стандартном векторе C-Brick четыре целевых сайта Cpf1 с префиксом T1 / T2 и суффикс T3 / T4 фланкируют биологические части; Это похоже на стандарт BioBrick. Поскольку расщепление сайтов T2 и T3 pСтимулирует комплементарные липкие концы, можно выполнить итерационную сборку частей ДНК, образуя шрам «GGATCC» между частями. Примечательно, что стандарт C-Brick имеет два основных преимущества: распознавание длинных последовательностей мишеней и отсутствие коротких шрамов. Шрам 6 гп «GGATCC», вырабатываемый C-Brick, кодирует Gly-Ser, что позволяет создавать гибридные белки. Кроме того, стандарт C-Brick также частично совместим со стандартами BglBrick и BioBrick.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описывается процедура для стандартного сборщика ДНК C-Brick. Наиболее важным шагом в этом протоколе является линеаризация стандартного вектора C-Brick; Неполное расщепление вектора может серьезно повлиять на скорость успеха. Кроме того, хотя Cpf1 главным образом расщепляет ц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Shanghai Tolo Biotech за техническую помощь во время разработки стандарта C-Brick. Эта работа была поддержана грантами Программы стратегических приоритетных исследований Академии наук Китая (грант № XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- Knight, T. . Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).
- Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
- Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
- Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
- Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
- Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).
