Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

DNA生物学的部分の標準化は、合成生物学の発展にとって重要である¹ 。 DNAアセンブリ手順の開発は、 臨機応変な実験設計に取って代わることができ、遺伝的構成要素をより大きなシステムに組み立てる際に生じる予想外の結果の多くを除去することができる。 BioBrick標準（BBF RFC 10）は、最も初期に提案されたDNAアセンブリ標準の1つでした。これは接頭配列（EcoRIおよびXbaI切断部位を含む）および接尾配列（SpeIおよびPstI切断部位を含む） ^{2,3を使用する} 。 XbaIとSpeIは相補的な凝集末端を有するため、XbaIとSpeIで切断されたBioBrick DNA部分を結合して、さらなる反復アセンブリのための新しいBioBrickを生成することができる。

BioBrick標準を使用していくつかの欠陥が確認されています⁴ 。例えば、8-bpの傷跡を生じる融合タンパク質の構築を可能にしないDNA部分の間に存在する。さらに、上記の4種類の6bpの制限部位をDNA部分から除去しなければならず、これは非常に不便である。最初の問題を解決するためにBglBrick標準が確立されました⁵ 。これは、6-bpの「GGATCT」傷跡を作り、Gly-Serを産生し、複数のタンパク質またはタンパク質ドメインの融合を可能にする。 iBrickは第2の問題に対処するために開発されました⁶ 。長いDNA配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）を使用します。 HE認識部位は天然のDNA配列にほとんど存在しないので、iBrick標準は、DNA配列を改変することなくiBrick部位の直接構築に使用することができる。しかし、iBrickスタンダードはDNA部分の間に21 bpの傷跡を残します。これは、その不評の理由です。

近年、クラスタリングされた規則的に間隔を置いた短い回文繰り返し（CRISPR）システムが急速に発展した。 CRISPR関連（Cas）タンパク質の中で、 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9エンドヌクレアーゼが現在広く使用されている。大部分は、平滑末端を有する二本鎖DNA切断（DSB）を導入する⁹ 。

2015年に、Zhangと共同研究者は、Cpf1（ PrevotellaとFrancisellaの CRISPR）を初めて特徴付けました 。それはクラス2型V CRISPR-Cas系に属し、CRISRP RNA（crRNA）誘導エンドヌクレアーゼ^10である。 Cas9とは異なり、Cpf1は、4または5ntの5 'オーバーハング^10を有するDSBを導入する。この特性に基づいて、Cpf1を用いてDNAアセンブリ標準C-Brick ⁴を開発した。 C-ブリック標準ベクターでは、接頭語T1 / T2および接尾辞付きT3 / T4の4つのCpf1標的部位が生物学的部分に隣接する。これはBioBrick標準に似ています。 T2およびT3部位の切断として、p相補的な粘着末端を生じるので、DNA部分の反復アセンブリを実施することが可能であり、一方パーツ間に「GGATCC」傷を生成することが可能である。特に、C-Brick標準には2つの主な利点があります。長いターゲットシーケンスを認識し、短い傷跡を残します。 C-ブリックによって生成された6bpの「GGATCC」傷は、融合タンパク質の構築を可能にするGly-Serをコードする。さらに、C-Brick標準もBglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。