Protocoles pour l'assemblage standard d'ADN de C-Brick utilisant Cpf1
Summary
La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l'ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d'assemblage d'ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.
Abstract
La protéine CPf1 associée au CRISPR clive l'ADN bicaténaire sous la direction de l'ARN CRISPR (CRRNA), générant des extrémités collantes. En raison de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour l'établissement d'une norme d'assemblage d'ADN appelée C-Brick, qui présente l'avantage de longs sites de reconnaissance et de cicatrices courtes. Sur un vecteur C-Brick standard, il existe quatre sites de reconnaissance Cpf1 – le préfixe (sites T1 et T2) et le suffixe (sites T3 et T4) – éléments d'ADN biologiques flanquant. Le clivage des sites T2 et T3 produit des extrémités collantes complémentaires, qui permettent l'assemblage de pièces d'ADN avec des sites T2 et T3. Pendant ce temps, une courte cicatrice "GGATCC" est générée entre les pièces après l'assemblage. Comme le plasmide nouvellement formé contient à nouveau les quatre sites de clivage Cpf1, la méthode permet l'assemblage itératif de pièces d'ADN, ce qui est similaire à celui des standards BioBrick et BglBrick. Une procédure décrivant l'utilisation de la norme C-Brick pour assembler des pièces d'ADNEst décrit ici. La norme C-Brick peut être largement utilisée par les scientifiques, les étudiants diplômés et les étudiants de premier cycle, et même les amateurs.
Introduction
La standardisation des parties biologiques de l'ADN est importante pour le développement de la biologie synthétique 1 . Le développement d'une procédure d'assemblage d'ADN peut remplacer des conceptions expérimentales ponctuelles et éliminer plusieurs des résultats inattendus qui surviennent lors de l'assemblage de composants génétiques dans des systèmes plus vastes. La norme BioBrick (BBF RFC 10) était l'une des premières normes d'assemblage d'ADN proposées. Il utilise la séquence de préfixe (contenant des sites de coupe EcoRI et XbaI) et la séquence de suffixe (contenant les sites de coupe SpeI et PstI) 2 , 3 . Étant donné que XbaI et SpeI ont des extrémités cohésives complémentaires, les pièces d'ADN BioBrick qui sont coupées avec XbaI et SpeI peuvent être jointes, générant un nouveau BioBrick pour un assemblage itératif supplémentaire.
Certains défauts ont été identifiés avec l'utilisation de la norme BioBrick 4 . Par exemple, il produit une cicatrice de 8 pbEntre les parties d'ADN, ce qui ne permet pas la construction de protéines in-fusion. En outre, les quatre types de sites de restriction de 6 pb susmentionnés doivent être retirés des pièces d'ADN, ce qui est très gênant. La norme BglBrick a été établie pour résoudre le premier problème 5 . Il crée une cicatrice "GGATCT" de 6 p. 100, produisant Gly-Ser et permettant la fusion de protéines multiples ou de domaines protéiques. IBrick a été développé pour traiter le deuxième problème 6 . Il utilise des endonucléases homing (HE) qui reconnaissent de longues séquences d'ADN. Comme les sites de reconnaissance HE existent rarement dans les séquences d'ADN naturelles, la norme iBrick peut être utilisée pour la construction directe de pièces iBrick sans modifier leurs séquences d'ADN. Cependant, la norme iBrick laisse une cicatrice de 21 pb entre les parties de l'ADN, ce qui pourrait être la raison de son impopularité.
Au cours des dernières années, les répétitions palindromiques courtes classées régulièrement (CRISPR) s'est développé rapidement 7 , 8 . Parmi les protéines associées au CRISPR (Cas), l'endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes est maintenant largement utilisée. Il introduit principalement des ruptures d'ADN bicaténaires (DSB) avec des extrémités franches 9 .
En 2015, Zhang et ses collègues ont caractérisé pour la première fois Cpf1 (CRISPR de Prevotella et Francisella 1). Il appartient au système CRISPR-Cas de classe 2 de type V et est une endonucléase 10 CRISRP (CRARN). Contrairement à Cas9, Cpf1 introduit un DSB avec un surtension de 5 ou 5 nt 5 '10. Sur la base de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour développer une norme d'assemblage d'ADN, C-Brick 4 . Sur un vecteur standard C-Brick, quatre sites Cpf1 de T1 / T2 préfixés et T3 / T4 suffixés flanquent les parties biologiques; Ceci est similaire à la norme BioBrick. Comme le clivage des sites T2 et T3 pTransforme les extrémités collantes complémentaires, il est possible d'effectuer l'assemblage itératif des pièces d'ADN tout en générant une cicatrice "GGATCC" entre les pièces. Notamment, la norme C-Brick a deux avantages principaux: reconnaître des séquences cibles longues et laisser des cicatrices courtes. La cicatrice "GGATCC" de 6 pb générée par C-Brick encode Gly-Ser, qui permet la construction de protéines de fusion. En outre, la norme C-Brick est également partiellement compatible avec les standards BglBrick et BioBrick.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une procédure pour la norme d'assemblage d'ADN C-Brick. L'étape la plus importante dans ce protocole est la linéarisation du vecteur standard C-Brick; Le clivage incomplet du vecteur pourrait affecter gravement le taux de réussite. En outre, bien que Cpf1 couvre principalement les séquences d'ADN cible dans le schéma de clivage "18-23", un clivage inexact près des deux bases a également été détecté 4 , ce qui peut provoquer un petit nombr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Shanghai Tolo Biotech pour son assistance technique lors du développement de la norme C-Brick. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de recherche prioritaire stratégique de l'Académie chinoise des sciences (Subvention n ° XDB19040200).
Materials
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| NTP mixture | Sangon | #ND0056 | |
| RRI(Recombinant RNase Inhibitor) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR buffer |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax for One-step Cloning | Tolobio | 24303-1 | seamless assembly kit |
| 5x Buffer for Ezmax One-step Cloning | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel and PCR clean-up system | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | plasmid preparation kit |
| thermosensitive alkaline phosphatase | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 buffer | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Luria-Bertani media (tryptone) | Oxoid | LP0042 | |
| Luria-Bertani media (yeast extract) | Oxoid | LP0021 | |
| Luria-Bertani media (NaCl) | Sangon Biotech | B126BA0007 |
References
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