Analyse approfondie de la méthylation d'ADN en utilisant un procédé de capture de domaine de liaison au méthyl-CpG dans les patients atteints de leucémie lymphocytaire chronique

L'utilisation de techniques de séquençage de la prochaine génération pour analyser les profils globaux de méthylation de l'ADN a été de plus en plus populaire au cours des dernières années. Des essais de méthylation à l'échelle du génome, y compris les méthodes à base de microarray et de microarray, ont été développés sur la base de ce qui suit: la conversion de bisulfite d'ADN génomique, les digestion enzymes de restriction sensibles à la méthylation et l'immunoprécipitation d'ADN méthylé en utilisant des anticorps spécifiques de méthyle CpG .

La méthylation d'ADN aberrante est l'une des caractéristiques de la leucémie et des lymphomes, y compris la leucémie lymphocytaire chronique (CLL). Plus tôt, plusieurs groupes, dont le nôtre, ont caractérisé les profils de méthylation de l'ADN de différents sous-groupes de pronostic de CLL et des contrôles de cellules B normaux et sains utilisant la conversion de bisulfite d'ADN génomique, suivis de méthodes à base de micro-ensembles ou de séquençage génomique complet ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. La conversion de bisulfite d'ADN génomique conduit à la désamination des cytosines non modifiées à l'uracile, laissant les cytosines méthylées modifiées dans le génome. Une fois converti, l'état de méthylation de l'ADN peut être déterminé par amplification et séquençage par PCR en utilisant différentes méthodes quantitatives ou qualitatives, telles que le séquençage de bisulfites à base de micro-ensembles ou de génome entier (WGBS). Bien que les méthodes basées sur la conversion du bisulfite présentent de nombreux avantages et sont largement utilisées dans différents types de cancer pour analyser les niveaux de méthylation de l'ADN, il existe quelques inconvénients associés à cette technique. Le séquençage WGBS permet une résolution par paire unique avec des quantités inférieures d'ADN et est l'option la mieux adaptée pour analyser un grand nombre d'échantillons. Cependant, cette méthode ne parvient pas à différencier les modifications entre les niveaux 5 mC et 5 hmC dans le génome ^{5 , 6} . En outre, les méthodes basées sur les microarray n'offrent pas complète cExcès de génome.

Dans une étude récente de notre laboratoire ⁷ , les méthodes basées sur l'immunoprécipitation, plutôt que la conversion des bisulfites, ont été utilisées pour identifier des régions hautement riches en CpG, différentiellement méthylées à l'échelle mondiale chez des patients CLL et des témoins sains normaux. Le séquençage de prochaine génération (MBD-seq) du domaine de liaison au méthyl-CpG (MBD), l'enrichissement de l'ADN fragmenté double brin dépend du degré de méthylation du CpG. Ce procédé peut surmonter les inconvénients du procédé de conversion du bisulfite et peut également fournir une couverture de la méthylisation du CpG à l'échelle du génome de manière indépendante et indépendante de la PCR. De plus, contrairement aux méthodes de microarray basées sur la conversion au bisulfite, MBD-seq peut être utilisé pour analyser l'état de méthylation des éléments répétitifs, tels que les longs éléments nucléaires entremêlés (LINE), les éléments nucléaires intermédiaires courts (SINE), les répétitions terminales longues (LTRS) Etc. Cependant, par rapport aux méthodes de conversion des bisulfites,Un protocole MBD-seq nécessite une quantité relativement importante d'ADN d'entrée. En outre, la qualité des lectures séquentielles et les données dépendent de la spécificité, de l'affinité et de la qualité des anticorps utilisés.

L'étude actuelle explique un protocole MBD-seq détaillé pour enrichir l'ADN méthylé pour le séquençage de la prochaine génération. Il utilise un kit commercial d'enrichissement en liaison d'ADN méthylé (répertorié dans la table Matériaux ), ainsi qu'un pipeline informatique pour visualiser et interpréter les données de séquençage de la méthylation afin d'identifier les régions hyper-hypométhylées spécifiques de CLL par rapport aux témoins sains normaux. Fondamentalement, cette méthode utilise la capacité de la MBD de l'interaction de la protéine MBD2 humaine avec les CpG méthylées pour extraire l'ADN enrichi en CpG méthylées, ce qui est suivi du séquençage à haut débit de l'ADN méthylé.