Analisi di supercomplexes della catena di trasporto elettronico mitocondriale con elettroforesi nativa, analisi in-gel e elettroelution
Summary
Questo protocollo descrive la separazione dei complessi funzionali della catena di trasporto elettronico mitocondriale (Cx) IV e dei suoi supercomplexi utilizzando l'elettroforesi nativa per rivelare informazioni sulla loro struttura e struttura. Il gel nativo può essere sottoposto a immunoblotting, analisi in-gel e purificazione mediante elettroelution per caratterizzare ulteriormente i singoli complessi.
Abstract
La catena di trasporto elettronico mitocondriale (ETC) trasforma l'energia derivata dalla rottura di vari combustibili nella valuta bioenergetica della cellula, ATP. L'ETC è composto da 5 complessi proteici massicci, che si riuniscono anche in supercomplexes chiamati respirasomi (CI, C-III e C-IV) e sintasi (CV) che aumentano l'efficienza del trasporto di elettroni e della produzione di ATP. Sono stati utilizzati diversi metodi per oltre 50 anni per misurare la funzione ETC, ma questi protocolli non forniscono informazioni sull'assemblaggio di singoli complessi e supercomplex. Questo protocollo descrive la tecnica dell'elettroforesi genica gel poliacrilammide (PAGE), un metodo modificato più di 20 anni fa per studiare la struttura complessa di ETC. L'elettroforesi nativa consente la separazione dei complessi ETC nelle loro forme attive, e questi complessi possono essere studiati utilizzando immunoblotting, test in-gel (IGA) e purificazione mediante elettroelution. Combinando il reI risultati di un gel nativo PAGE con quelli di altri test mitocondriali, è possibile ottenere un quadro completo dell'attività ETC, del suo assemblaggio dinamico e dello smontaggio e come questo regola la struttura e la funzione mitocondriale. Questo lavoro discuterà anche i limiti di queste tecniche. In sintesi, la tecnica della PAGE nativa, seguita da immunoblotting, IGA e elettroelution, presentata sotto, è un modo potente per studiare la funzionalità e la composizione dei supercomplex mitocondriali ETC.
Introduction
L'energia mitocondriale sotto forma di ATP non è solo essenziale per la sopravvivenza cellulare, ma anche per la regolazione della morte cellulare. La generazione di ATP da fosforilazione ossidativa richiede una catena funzionale di trasporto di elettroni (ETC; Cx-I-IV) e mitocondriale ATP sintasi (Cx-V). Recenti studi hanno dimostrato che questi grandi complessi proteici sono organizzati in supercomplex, chiamati respirasomi e sintasi 1 , 2 . È impegnativo analizzare l'assemblaggio, la dinamica e la regolazione delle attività di questi complessi e supercomplexi massicci. Mentre le misurazioni del consumo di ossigeno prese con un esame di elettrodi di ossigeno e di enzimi condotti utilizzando uno spettrofotometro possono fornire preziose informazioni sull'attività complessa del ETC, questi dosaggi non possono fornire informazioni riguardanti la presenza, la dimensione e la composizione subunità del complesso proteico o dei supercomplexi coinvolti. Tuttavia, lo sviluppo di nativi azzurri e chiari (BN e CN) PAGE 3 ha creato un potente strumento per rivelare importanti informazioni sulla composizione complessiva e sull'assemblaggio / smontaggio e sulla regolazione dinamica dell'organizzazione supramolecolare di questi complessi respiratori vitali in condizioni fisiologiche e patologiche 4 .
L'assemblaggio di questi complessi in supercomplex di ordine superiore sembra regolare la struttura mitocondriale e la funzione 5 . Ad esempio, il complesso respiratorio aumenta l'efficienza del trasferimento di elettroni e la generazione della forza motrice protonica attraverso la membrana interna mitocondriale 5 . Inoltre, l'assemblaggio di sintasi non solo aumenta l'efficienza della produzione di ATP e il trasferimento di equivalenti energetici nel citoplasma 2 , ma anche forma la membrana interna mitocondriale nella crista tubolare 6 ,/ Sup> 7 . Studi di assemblaggio supercomplex durante lo sviluppo cardiaco in embrioni di topi mostrano che la generazione di supercomplex contenenti Cx-I nel cuore inizia a circa il giorno embrionale 13.5 8 . Altri hanno dimostrato che la quantità di supercomplex contenenti Cx-I diminuisce nel cuore a causa dell'invecchiamento o delle lesioni di reazioni di ischemia / reperfusione 9 , 10 o possono svolgere un ruolo nella progressione delle malattie neurodegenerative 11 .
Questo protocollo descrive metodi per PAGE nativo di gel che può essere utilizzato per indagare l'assemblaggio e l'attività dei complessi ETC e dei supercomplex. Il peso molecolare approssimativo dei supercomplex mitocondriali può essere valutato separando i complessi proteici in gel di poliacrilammide CN o BN. CN PAGE consente anche la visualizzazione dell'attività enzimatica di tutti i complessi mitocondriali direttamente nel gel (in-gel assay;IGA) 12 . Questo lavoro dimostra l'attività dei respirasomi evidenziando la capacità di Cx-I di ossidare NADH attraverso l'IGA e la presenza di sintassi derivanti dall'attività di idrolisi ATP di Cx-V da parte di IGA. I complessi multipli e i supercomplex contenenti Cx-I e Cx-V possono anche essere dimostrati trasferendo le proteine sulle membrane di nitrocellulosa e eseguendo immunoblotting. Il vantaggio di questo approccio è che BN o CN PAGE in genere separano i complessi proteici in base alla loro dimensione e composizione fisiologica; Il trasferimento a una membrana conserva questo modello di bande. L'analisi dei complessi proteici in una BN o in CN PAGE può essere effettuata anche utilizzando la 2D-PAGE (vedere Fiala et al. 13 per una dimostrazione) o mediante centrifugazione di densità di saccarosio 14 , 15 . Per analizzare ulteriormente una banda specifica, è possibile escoggersi dalla BN PAGE e le proteine di questo complesso proteico possono essere purificateD elettrolientandoli in condizioni naturali. L'elettroelution nativo può essere eseguito entro poche ore, che potrebbe fare una differenza significativa alla diffusione passiva (come usato nel riferimento 16) di proteine da un gel nel buffer circostante.
In sintesi, questi metodi descrivono diversi approcci che consentono l'ulteriore caratterizzazione di supercomplex di peso molecolare dalle membrane mitocondriali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un ETC funzionale è necessario per la generazione di ATP mitocondriale. I complessi dell'ETC sono in grado di formare due tipi di supercomplex: i respirasomi (Cx-I, -III e -IV) 1 ei sintasi (Cx-V) 2 . L'assemblaggio di ogni complesso è richiesto per un ETC intatto, mentre l'organizzazione dell'ETC in supercomplexes è pensata per aumentare l'efficienza complessiva ETC 5 , 22 . Come questi comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Heart Association's Founder's Affiliate [12GRNT12060233] e del Forte Centri di Ricerca per l'infanzia presso l'Università di Rochester.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
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