ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג'ל, ו Electroelution
Summary
פרוטוקול זה מתאר את ההפרדה של מיטוכונדריאלי תפקודי שרשרת התחבורה אלקטרונים מתח (Cx) IV ו supercomplexes מהם באמצעות אלקטרופורזה יליד לחשוף מידע על הרכבה שלהם המבנה. ג'ל הילידים יכול להיות נתון immunoblotting, מבחני ג'ל, וטיהור על ידי electroelution כדי לאפיין עוד קומפלקסים בודדים.
Abstract
רשת ההולכה המיטוכונדריאלית (ETC) מייצרת את האנרגיה הנגזרת מהתפלגות של דלקים שונים למטבע הביו-אנרגטי של התא, ATP. ה- ETC מורכב מ -5 מתחמי חלבון מסיבי, אשר גם להרכיב סופר קומפלקסים הנקראים respirasomes (CI, C-III, ו- C-IV) ו synthasomes (קורות חיים) המגבירים את היעילות של התחבורה אלקטרונים הייצור ATP. שיטות שונות שימשו במשך למעלה מ -50 שנה כדי למדוד את הפונקציה ETC, אבל פרוטוקולים אלה אינם מספקים מידע על הרכבה של קומפלקסים בודדים supercomplexes. פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של ג 'ל הילידים polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (PAGE), שיטה ששונה לפני יותר מ -20 שנה ללמוד מבנה מורכבים ETC. יליד אלקטרופורזה מאפשר הפרדה של מתחמי ETC לתוך צורות פעיל שלהם, ואז קומפלקסים אלה ניתן ללמוד באמצעות immunoblotting, מבחני ג'ל (IGA), וטיהור על ידי electroelution. על ידי שילוב מחדשSults של ג 'ל הילידים PAGE עם אלה של מבחני המיטוכונדריה אחרים, ניתן להשיג תמונה completer של פעילות ETC, הרכבה דינמי שלה פירוק, וכיצד זה מווסת מבנה המיטוכונדריה ותפקוד. עבודה זו תדון גם במגבלות של טכניקות אלה. לסיכום, הטכניקה של הילידים PAGE, ואחריו immunoblotting, IGA, electroelution, המוצגת להלן, היא דרך רבת עוצמה לחקור את הפונקציונליות ואת ההרכב של supercomplexes המיטוכונדריה ETC.
Introduction
אנרגיה מיטוכונדריאלית בצורה של ATP אינה חיונית רק להישרדות התא, אלא גם להסדרת מוות התא. הדור של ATP על ידי זירזון חמצוני דורש שרשרת תובלה אלקטרונית תפקודית (ETC, Cx-I ל- IV) ו synthase ATP המיטוכונדריה (Cx-V). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אלה קומפלקסים חלבונים גדולים מאורגנים supercomplexes, נקרא respirasomes ו synthasomes 1 , 2 . זה מאתגר לנתח את הרכבה, דינמיקה, ויסות הפעילות של אלה קומפלקסים מסיבי supercomplexes. בעוד מדידות צריכת חמצן שנלקחו עם אלקטרודה חמצן מבחני אנזים שנערכו באמצעות ספקטרופוטומטר יכול לתת מידע בעל ערך על פעילות מורכבים ETC, מבחני אלה לא יכולים לספק מידע לגבי נוכחות, גודל, הרכב הרכב משנה של קומפלקס חלבון או supercomplexes המעורבים. עם זאת, פיתוח של יליד כחול ברור (BN ו- CN, בהתאמה) עמוד 3 יצרה כלי רב עוצמה לחשוף מידע חשוב על הרכב מורכבים הרכבה / פירוק ועל הרגולציה הדינמית של הארגון supramolecular של אלה מתחמי הנשימה חיוני בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים 4 .
הרכבה של קומפלקסים אלה לתוך supercomplexes בסדר גבוה יותר נראה להסדיר מבנה המיטוכונדריה ותפקוד 5 . לדוגמה, הרכבה respirasome מגביר את היעילות של העברת אלקטרונים ואת הדור של כוח המניע פרוטון על פני קרום פנימי המיטוכונדריה 5 . בנוסף, הרכבה של synthasomes לא רק מגביר את היעילות של ייצור ה- ATP והעברת שווי אנרגיה לתוך הציטופלסמה 2 , אבל זה גם עובש את הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי לתוך cristae 6 צינורי ,/ Sup> 7 . מחקרים של הרכבה supercomplex במהלך התפתחות הלב בעוברים עכבר עולה כי הדור של Cx-I המכילים supercomplexes בלב מתחיל בערך ביום עובריים 13.5 8 . אחרים הראו כי כמות supercomplexes המכיל Cx-I פוחתת בלב עקב הזדקנות או איסכמיה / reperfusion פציעות 9 , 10 או יכול לשחק תפקיד בהתקדמות של מחלות ניווניות 11 .
פרוטוקול זה מתאר שיטות ג 'ל הילידים PAGE שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הרכבה ופעילות של מתחמי ETC ו supercomplexes. המשקל המולקולרי המשוער של supercomplexes המיטוכונדריה ניתן להעריך על ידי הפרדת מתחמי חלבון CN או BN polyacrylamide ג'לים. CN PAGE גם מאפשר הדמיה של הפעילות האנזימטית של כל מתחמי המיטוכונדריה ישירות הג'ל (ב-מבחני ג'ל;IGA) 12 . עבודה זו מדגימה את הפעילות של respirasomes על ידי הדגשת היכולת של Cx-I לחמצן NADH דרך IGA ואת נוכחות של synthasomes בשל פעילות ATP- hydrolyzing של CX-V על ידי IGA. קומפלקסים מרובים supercomplexes המכילים Cx-I ו CX-V יכול גם להיות הוכח על ידי העברת חלבונים על גבי קרומי ניטרוצלולוזה וביצוע immunoblotting. היתרון של גישה זו היא כי BN או CN PAGE בדרך כלל מפריד מתחמי חלבון על פי גודל פיזיולוגי שלהם הרכב; ההעברה לקרום משמרת תבנית זו של להקות. ניתוח מתחמי חלבון בדף BN או CN יכול להיעשות גם באמצעות 2D-PAGE (ראה Fiala et al 13 להפגנה) או על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז 14 , 15 . כדי לנתח עוד להקה ספציפית, זה יכול להיות נכרת מן דף BN, ואת החלבונים ממכלול חלבון זה יכול להיות purifieד על ידי electroeluting אותם בתנאים הילידים. Electroution יליד יכול להתבצע בתוך כמה שעות, אשר יכול לעשות הבדל משמעותי דיפוזיה פסיבית (כמו בשימוש הפניה 16) של חלבונים מן ג'ל לתוך חיץ הסובבים.
לסיכום, שיטות אלה מתארות מספר גישות המאפשרות את אפיון נוסף של supercomplexes משקל מולקולרית גבוהה ממברנות המיטוכונדריה.
Protocol
Representative Results
Discussion
A פונקציונלי ETC הוא הכרחי עבור הדור המיטוכונדריה ATP. קומפלקסים של ETC מסוגלים ליצור שני סוגים של supercomplexes: respirasomes (Cx-I, IIII, ו- IV) 1 ואת synthasomes (Cx-V) 2 . הרכבה של כל מורכבות נדרשת עבור ETC שלם, בעוד הארגון של ETC לתוך supercomplexes נחשב להגביר את יעילות ETC הכוללת <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן השותף האמריקאי של איגוד הלב של שותף [12GRNT12060233] ואת חזקה לילדים מרכז המחקר באוניברסיטת רוצ'סטר.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
