Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Mitochondriale Energie in Form von ATP ist nicht nur essentiell für das Zellüberleben, sondern auch für die Regulation des Zelltods. Die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung erfordert eine funktionelle Elektronentransportkette (ETC, Cx-I bis IV) und mitochondriale ATP-Synthase (Cx-V). Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese großen Proteinkomplexe zu Superkomplexen, sogenannten respirasomen und Synthasomen ^{1 , 2 ,} organisiert ^sind . Es ist anspruchsvoll, die Montage-, Dynamik- und Aktivitätsregulierung dieser massiven Komplexe und Superkomplexe zu analysieren. Während Sauerstoffverbrauchsmessungen, die mit einer Sauerstoffelektrode durchgeführt wurden, und Enzymtests, die unter Verwendung eines Spektrophotometers durchgeführt wurden, wertvolle Informationen über die ETC-Komplexaktivität liefern können, können diese Assays keine Information über die Anwesenheit, die Größe und die Untereinheitszusammensetzung des Proteinkomplexes oder der betroffenen Superkomplexe liefern. Allerdings ist die Entwicklung von blau und klar native (BN und CN) SEITE ³ hat ein leistungsfähiges Werkzeug geschaffen, um wichtige Informationen über komplexe Komposition und Montage / Demontage und über die dynamische Regulierung der supramolekularen Organisation dieser lebenswichtigen Atmungskomplexe unter physiologischen und pathologischen Zuständen aufzudecken.

Die Zusammenstellung dieser Komplexe in übergeordnete Superkomplexe scheint die mitochondriale Struktur und Funktion ⁵ zu regulieren. Beispielsweise erhöht die respirasome Anordnung den Wirkungsgrad des Elektronentransfers und die Erzeugung der Protonenmotivkraft über die mitochondriale innere Membran ⁵ . Darüber hinaus erhöht die Zusammenstellung von Synthasomen nicht nur die Effizienz der ATP-Produktion und die Übertragung von Energieäquivalenten in das Zytoplasma ² , sondern auch die mitochondriale innere Membran in die tubuläre Cristae ^{6 , <}/ Sup> ⁷ Untersuchungen der superkomplexen Assemblierung bei der Herzentwicklung bei Mausembryonen zeigen, dass die Erzeugung von Cx-I-haltigen Supercomplexen im Herzen bei etwa embryonalen Tag 13,5 ⁸ beginnt. Andere haben gezeigt, dass die Menge an Cx-I-haltigen Superkomplexen im Herzen aufgrund von Alterung oder Ischämie / Reperfusionsverletzungen ^{9 , 10} abnimmt oder eine Rolle bei der Progression neurodegenerativer Erkrankungen spielen kann ¹¹ .

Dieses Protokoll beschreibt Methoden für native Gel-PAGE, die verwendet werden können, um die Zusammenstellung und Aktivität der ETC-Komplexe und Superkomplexe zu untersuchen. Das ungefähre Molekulargewicht von mitochondrialen Superkomplexen kann durch Trennen der Proteinkomplexe in CN- oder BN-Polyacrylamidgelen bestimmt werden. CN-PAGE ermöglicht auch die Visualisierung der enzymatischen Aktivität aller mitochondrialen Komplexe direkt im Gel (In-Gel-Assays;IGA) ¹² . Diese Arbeit zeigt die Aktivität von respirasomen, indem sie die Fähigkeit von Cx-I, NADH durch IGA zu oxidieren, und die Anwesenheit von Synthasomen aufgrund der ATP-hydrolysierenden Aktivität von Cx-V durch IGA hervorhebt. Die Mehrfachkomplexe und die Cx-I und Cx-V enthaltenden Komplexe können auch durch Übertragung der Proteine ​​auf Nitrozellulosemembranen und Durchführen von Immunoblotting nachgewiesen werden. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass BN oder CN PAGE im Allgemeinen Proteinkomplexe auf der Grundlage ihrer physiologischen Größe und Zusammensetzung trennt; Der Transfer zu einer Membran bewahrt dieses Muster von Bändern. Die Analyse von Proteinkomplexen in einer BN- oder CN-PAGE kann auch mit 2D-PAGE durchgeführt werden (siehe Fiala et al., ¹³ für eine Demonstration) oder durch Saccharose-Dichte-Zentrifugation ^{14 , 15} . Um ein bestimmtes Band weiter zu analysieren, kann es aus der BN PAGE herausgeschnitten werden, und die Proteine ​​aus diesem Proteinkomplex können gereinigt werdenD durch elektrolytieren sie unter nativen Bedingungen. Eine native Elektroelution kann innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden, was einen signifikanten Unterschied zur passiven Diffusion (wie in Referenz 16 verwendet) von Proteinen aus einem Gel in den umgebenden Puffer machen könnte.

Zusammenfassend beschreiben diese Methoden mehrere Ansätze, die die weitere Charakterisierung von hochmolekularen Superkomplexen aus mitochondrialen Membranen ermöglichen.