Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

Mitochondriale energie in de vorm van ATP is niet alleen essentieel voor de overleving van cellen, maar ook voor de regulering van de cel dood. De generatie van ATP door oxidatieve fosforylering vereist een functionele elektronen transportketen (ETC, Cx-I tot IV) en mitochondriale ATP synthase (Cx-V). Recente studies hebben aangetoond dat deze grote eiwitcomplexen in supercomplexen worden georganiseerd, respirasomen en synthasomen ^{1 , 2 genoemd} . Het is uitdagend om de assemblage, dynamiek en activiteitregulering van deze massale complexen en supercomplexen te analyseren. Terwijl zuurstofverbruiksmetingen die zijn genomen met een zuurstofelektrode en enzymassays die worden uitgevoerd met behulp van een spectrofotometer, waardevolle informatie over ETC-complexe activiteit kunnen geven, kunnen deze analyses geen informatie verschaffen over de aanwezigheid, grootte en subeenheidssamenstelling van het betrokken eiwitcomplex of supercomplexen. De ontwikkeling van blauw en duidelijk natuurlijk (BN en CN) PAGINA ³ heeft een krachtig instrument gecreëerd voor het onthullen van belangrijke informatie over complexe samenstelling en montage / demontage en over de dynamische regulering van de supramoleculaire organisatie van deze vitale ademhalingscomplexen onder fysiologische en pathologische aandoeningen ⁴ .

De montage van deze complexen in hogere orde supercomplexen lijkt de mitochondriale structuur en functie ^{5 te} reguleren. Bijvoorbeeld, respirasome assemblage verhoogt de efficiëntie van elektronoverdracht en de generatie van de protonmotief kracht over het mitochondriale binnenmembraan ⁵ . Bovendien verhoogt de assemblage van synthasomen niet alleen de efficiëntie van ATP-productie en de overdracht van energie-equivalenten in de cytoplasma ² , maar vormt ook het mitochondriale binnenmembraan in de buisvormige cristae ^{6 , <}/ Sup> ⁷ . Studies van supercomplexe assemblage tijdens hartontwikkeling in muisembryo's tonen aan dat de opwekking van Cx-I-bevattende supercomplexen in het hart begint op ongeveer embryonale dag 13,5 ⁸ . Anderen hebben aangetoond dat de hoeveelheid Cx-I-bevattende supercomplexen afneemt in het hart door aging of ischemie / reperfusie verwondingen ^{9 , 10} of kan een rol spelen bij de progressie van neurodegeneratieve ziekten ¹¹ .

Dit protocol beschrijft methoden voor native gel PAGE die kunnen worden gebruikt om de assemblage en activiteit van de ETC complexen en supercomplexen te onderzoeken. Het geschatte molecuulgewicht van mitochondriale supercomplexen kan worden beoordeeld door het scheiden van de eiwitcomplexen in CN- of BN-polyacrylamidegelen. CN PAGE staat ook toe voor het visualiseren van de enzymatische activiteit van alle mitochondriale complexen direct in de gel (in-gel assays;IGA) ¹² . Dit werk demonstreert de activiteit van de respirasomen door het vermogen van Cx-I om NADH door IGA te oxideren en de aanwezigheid van synthasomen te wijzen door de ATP-hydrolyserende activiteit van Cx-V door IGA. De meervoudige complexen en supercomplexen die Cx-I en Cx-V bevatten, kunnen ook worden aangetoond door de eiwitten over te brengen op nitrocellulosemembranen en immunoblotting uit te voeren. Het voordeel van deze aanpak is dat BN of CN PAGE in het algemeen scheidt eiwitcomplexen op basis van hun fysiologische grootte en samenstelling; De overdracht naar een membraan behoudt dit patroon van banden. Analyse van eiwitcomplexen in een BN of CN PAGE kan ook worden uitgevoerd met behulp van 2D-PAGE (zie Fiala et al. ¹³ voor een demonstratie) of door middel van sucrose-dichtheidcentrifugatie ^{14 , 15} . Om een ​​specifieke band verder te analyseren kan het worden uitgesneden uit de BN PAGE, en de eiwitten uit dit eiwitcomplex kunnen purifie zijnD door ze te electroeluteren onder natieve omstandigheden. Inheemse elektroelutie kan binnen enkele uren uitgevoerd worden, wat een significant verschil zou kunnen maken voor de passieve diffusie (zoals gebruikt in Referentie 16) van eiwitten van een gel in de omliggende buffer.

Samengevat beschrijven deze werkwijzen verschillende benaderingen die het mogelijk maken de verdere karakterisering van supermoleculen met een hoge molecuulgewicht van mitochondriale membranen mogelijk te maken.