Количественное определение пигментации брюшной полости в<em> Drosophila melanogaster</em

Пигментация показывает огромные фенотипические различия между видами, популяциями и индивидуумами и даже внутри индивидуумов во время онтогенеза ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Несмотря на многочисленные исследования пигментации у самых разных животных, пигментация, пожалуй, лучше всего изучалась у Drosophila melanogaster , где полная сила молекулярной генетики использовалась для выяснения механизмов развития и физиологии, которые регулируют пигментацию и как эти механизмы развиваются ^{1 , 6} . Многое известно о генах, которые регулируют биохимический синтез пигментов в D. melanogaster ^{7 , 8} и генах, которые контролируют временную и пространственную диСтроение этого биосинтеза ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Кроме того, генетическое картирование выявило генетические локусы, лежащие в основе внутри- и межвидовых различий в пигментации у D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} . Также были изучены взаимосвязи между пигментацией и плейотропными чертами, такими как поведение ^{18 , 19} и иммунитет ^{19 , 20} , а также адаптивное значение рисунков пигментации ^{15 , 21 , 22} . Таким образом, пигментация в D. melanogaster появилась как мощный, но простой mДля разработки и эволюции сложных фенотипов.

Пигментация у взрослых D. melanogaster характеризуется различными формами меланизации по всему телу, особенно на крыльях, спинной грудной клетке и животе. Это пигментация каждой кутикулярной пластины (тергита) на дорзальном животе, однако, которая получила наибольшее внимание для исследования. Значительные различия в этой пигментации ( рис. 1А- Ф) обусловлены как генетическими ^{17 , 23, так} и экологическими ^{24 , 25} факторами. Кутикула брюшного тергита состоит из передних и задних отделов развития ( рис. 1G ), каждая из которых может быть дополнительно разделена в зависимости от пигментации и орнамента ²⁶ . Передний отдел включает шесть кутикулы(A1-a6), а задний отсек включает три (p1-p3) ( рисунок 1G ). Из них кутикула p1, p2 и a1 обычно складывают под тергитом в невытянутых брюшных полотнах, так что они скрыты. Надежная видимая кутикула характеризуется полосой тяжелой пигментации, здесь называемой «пигментной лентой», состоящей из типов кутикулы a4 (волосатая с умеренными щетинками) и a5 (волосатая с большими щетинками), с задним краем полосы Более интенсивно пигментированный, чем передний край ( рис. 1G ). Перед этой полосой находится область слегка пигментированной волосатой кутикулы, которая имеет щетину назад (а3), но не вперед (а2). Изменение пигментации между мухами наблюдается как в интенсивности пигментации, так и в ширине пигментной полосы. В целом, самые большие изменения в большинстве задних сегментов (брюшные сегменты 5, 6 и 7) и ниже в более передних сегментах (брюшное сечениеПункты 3 и 4) ²⁴ . Кроме того, в пигментации D. melanogaster существует половой диморфизм, причем самцы обычно имеют полностью пигментированные пятый и шестой брюшные тергиты ( рис. 4C ).

В большинстве исследований пигментации брюшной полости у D. melanogaster пигментация рассматривалась как категориальный или ординальный признак, при этом образец качественно измерялся ^{27 , 28 , 29} или полуколичественно по шкале ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35}, ^{36 , 37} . Эти методы неизбежно страдают от недостатка точности, и поскольку они полагаются на субъективную оценку пигментации, трудно сравнивать данные по исследованиям. Несколько авторов определили пространственные размеры пигментации ^{38 , 39} , интенсивность пигментации определенного типа кутикулы ^{23 , 25 , 39 , 40} или среднюю интенсивность пигментации по всему тергиту брюшной полости в целом ^{41 , 42 , 43} . Тем не менее, эти методы количественной оценки не измеряют как интенсивность, так и пространственное распределение брюшной пигментации одновременно и, следовательно, не фиксируют нюансов о том, как пигментация изменяется в зависимости от abdОминальный тергит. Кроме того, некоторые из этих способов ^{38 , 41 , 42 , 43} количественного определения требуют вскрытия и монтажа брюшной кутикулы. Это требует много времени и разрушает образец, что делает его недоступным для дополнительного морфологического анализа. По мере углубления понимания развития и развития абдоминальной пигментации потребуются более сложные инструменты для быстрого и точного измерения как пространственного распределения, так и интенсивности пигментации.

Общая цель этого метода заключается в использовании цифрового анализа изображений для получения реплицируемой и более точной меры брюшной пигментации в D. melanogaster . Методология включает три этапа. Во-первых, взрослая муха неразрушающе монтируется и берется цифровое изображение дорзального живота. Во-вторых, используя макрос ImageJ, пользовательОпределяет переднюю заднюю полосу пикселей, которая простирается от передней части кутикулы a2 до задней части кукурузы a5 (зеленая коробка, рисунок 1G ) как на третьем, так и на четвертом брюшных сегментах. Среднее значение пикселя по ширине этой полосы затем извлекается вдоль ее длинной оси, создавая профиль, который фиксирует пространственное распределение и интенсивность пигментации, когда он изменяется от передней к задней части тергита. В-третьих, сценарий R используется для описания профиля пигментации математически с использованием кубического сплайна. Сценарий R затем использует сплайн и его первую и вторую производные для извлечения ширины кутикулы a2-a5, ширины полосы пигмента и максимального и минимального уровней пигментации. Таким образом, этот метод количественно определяет как пространственные характеристики, так и глубину пигментации брюшной полости.

Эта методика количественно определяет пигментацию третьего и четвертого тергитов брюшной полости,Которые были в центре внимания многочисленных предыдущих исследований ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , либо исключительно, либо в сочетании с более поздними тергитами. Хотя и менее переменный, чем пятый и шестой тергиты брюшной полости, третий и четвертый тергиты не полностью пигментированы у самцов, поэтому этот протокол может применяться как для мужчин, так и для женщин. Тем не менее, как показано здесь, протокол может использоваться для измерения пигментации в пятом и шестом брюшных тергитах у женщин. Кроме того, незначительные модификации сценариев, используемых для извлечения характеристик профиля пигментации, должны позволять использовать этот метод для количественной оценки изменения пигментации в широком спектре другихорганизмы.