Quantificazione della pigmentazione addominale in<em> Drosophila melanogaster</em

La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all'interno di individui durante l'ontogenesi ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un'ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono ^{1 , 6} . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster ^{7 , 8} ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento ^{18 , 19} e l'immunità ^{19 , 20} , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione ^{15 , 21 , 22} . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l'evoluzione di fenotipi complessi.

La pigmentazione nell'adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull'addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull'addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C'è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici ^{17 , 23} che quelli ambientali ^{24 , 25} fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell'ornamento ²⁶ . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una "banda di pigmento", composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ​​ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell'intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) ²⁴ . Inoltre, c'è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ).

Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato ^{27 , 28 , 29} o semi-quantitativamente su scala ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35}, ^{36 , 37} . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione ^{38 , 39} , l'intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola ^{23 , 25 , 39 , 40} , o l'intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso ^{41 , 42 , 43} . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l'intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione ^{38 , 41 , 42 , 43} richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell'evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l'intensità della pigmentazione.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l'analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un'immagine digitale dell'addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l'utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall'anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l'intensità della pigmentazione in quanto cambia dall'anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale.

Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un'ampia varietà di altreorganismi.