Kwantificering van buikpigmentatie in<em> Drosophila melanogaster</em

Pigmentatie toont een enorme fenotypische variatie tussen soorten, populaties en individuen, en zelfs bij individuen tijdens ontogenie ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Hoewel er veel studies zijn over pigmentatie in een grote verscheidenheid aan dieren, is pigmentatie wellicht het beste bestudeerd in Drosophila melanogaster , waar de volledige kracht van de moleculaire genetica is gebruikt om de ontwikkelings- en fysiologische mechanismen die pigmentatie regelen en hoe deze mechanismen evolueren ^{1 toe te} lichten ^{, 6} . Er is veel bekend over de genen die de biochemische synthese van pigmenten regelen in D. melanogaster ^{7 , 8} en de genen die de temporale en ruimtelijke diVerdeling van deze biosynthese ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Bovendien heeft genetische mapping de genetische loci onderliggende intra- en interspecifieke verschillen in pigmentatie in D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} geïdentificeerd . De relaties tussen pigmentatie en pleiotropische eigenschappen, zoals gedrag ^{18 , 19} en immuniteit ^{19 , 20} , zijn ook onderzocht, evenals de adaptieve betekenis van pigmentatiepatronen ^{15 , 21 , 22} . Als zodanig is pigmentatie in D. melanogaster ontstaan ​​als een krachtige maar simpele mOdel voor de ontwikkeling en evolutie van complexe fenotypes.

Pigmentatie in volwassen D. melanogaster wordt gekenmerkt door verschillende melanisatiepatronen over het lichaam, met name op de vleugels en dorsale thorax en buik. Het is de pigmentatie van elke cutikulaire plaat (tergiet) op de dorsale buik, maar dat heeft de meeste onderzoeks aandacht gekregen. Er is aanzienlijke variatie in deze pigmentatie ( Figuur 1A -F ), door beide genetische ^{17 , 23} en milieu ^{24 , 25} factoren. De kutikula van een buiktergiet bestaat uit voorste en achterste ontwikkelingscompartimenten ( Figuur 1G ), die elk verder onderverdeeld kunnen worden, afhankelijk van pigmentatie en versiering ²⁶ . Het voorste compartiment bevat zes kutikulaTypen (a1-a6), en het achterste compartiment omvat drie (p1-p3) ( figuur 1G ). Van deze worden de p1-, p2- en a1-kutikula typisch gevouwen onder de tergiet in onuitgespreide abdomenen, zodat ze verborgen zijn. De betrouwbare zichtbare kutikula wordt gekenmerkt door een band met zware pigmentatie, hierna aangeduid als een pigmentband, bestaande uit kutikeltypes a4 (harig met matige borstels) en a5 (harig met grote borstels), met de achterste rand van de band Meer intensief gepigmenteerd dan de voorste rand ( figuur 1G ). Voorkant van deze band is een gebied van licht gepigmenteerde harige kutikula, die achterste achterkant (a3) ​​maar niet anterior (a2) heeft. Variatie in pigmentatie tussen vliegen wordt waargenomen in zowel de intensiteit van pigmentatie als in de breedte van de pigmentband. In het algemeen is variatie het grootste in de meest achterste segmenten (abdominale segmenten 5, 6 en 7) en is lager in de meer anterior segmenten (buikzeeGents 3 en 4) ²⁴ . Verder is er een seksuele dimorfie in D. melanogaster pigmentatie, waarbij mannen meestal volledig gepigmenteerde vijfde en zesde buiktergieten hebben ( Figuur 4C ).

In de meeste studies van buikpigmentatie in D. melanogaster is pigmentatie behandeld als een categorische of ordinale eigenschap, waarbij het patroon kwalitatief ^{27 , 28 , 29} of semi-kwantitatief wordt gemeten op een schaal ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37} . Deze methoden hebben onvermijdelijk een gebrek aan precisie, en omdat ze vertrouwen op de subjectieve beoordeling van pigmentatie, is het moeilijk om de gegevens over studies te vergelijken. Verscheidene auteurs hebben de ruimtelijke dimensies van pigmentatie ^{38 , 39} gekwantificeerd, de intensiteit van pigmentatie van een bepaald kutikeltype ^{23 , 25 , 39 , 40} of de gemiddelde intensiteit van pigmentatie over de buiktergiet als geheel ^{41 , 42 , 43} . Desalniettemin meet deze kwantificatiewerkwijzen echter niet de intensiteit en de ruimtelijke verdeling van buikpigmentatie tegelijkertijd en derhalve niet de nuances van hoe pigmentatie varieert over de abdOminale tergiet Verder vereisen verscheidene van deze kwantificatiewerkwijzen ^{38 , 41 , 42 , 43} de dissectie en montage van de buikspieren. Dit is zowel tijdrovend en vernietigt het monster, waardoor het niet meer beschikbaar is voor aanvullende morfologische analyses. Aangezien het begrip van de ontwikkeling en evolutie van buikpigmentatie verdiept, zullen meer geavanceerde hulpmiddelen nodig zijn om snel en nauwkeurig zowel de ruimtelijke verdeling als de intensiteit van pigmentatie te meten.

Het algemene doel van deze methode is het gebruik van digitale beeldanalyse om een ​​replicabele en nauwkeuriger maatregel van de buikpigmentatie in D. melanogaster te verkrijgen . De methodologie omvat drie fasen. Ten eerste is de volwassen vlieg niet destructief gemonteerd en wordt een digitaal beeld van de dorsale buik genomen. Ten tweede, met behulp van een ImageJ macro, de gebruikerDefinieert een anterior-posterior strook pixels die zich uitstrekken van de voorkant van de a2-cuticle naar de achterkant van de a5-cuticle (groene doos, figuur 1G ) op zowel de derde als vierde buikspijkers. De gemiddelde pixelwaarde over de breedte van deze strip wordt vervolgens langs zijn lange as geëxtraheerd, waardoor een profiel wordt verkregen dat de ruimtelijke verdeling en intensiteit van pigmentatie vastlegt als het van de voorste naar de achterkant van de tergiet verandert. Ten derde wordt een R-script gebruikt om het pigmentatieprofiel wiskundig te beschrijven met behulp van een kubieke spline. Het R-script gebruikt dan de spline en zijn eerste en tweede afgeleide om de breedte van de a2-a5-kutikula, de breedte van de pigmentband en de maximale en minimumpigmenten van pigmentatie te extraheren. De methode kent dus zowel de ruimtelijke eigenschappen als de diepte van de buikpigmentatie.

Deze methodologie kwantificeert de pigmentatie van de derde en vierde abdominale tergieten,Die de focus zijn geweest van tal van eerdere studies ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , ofwel uitsluitend of in combinatie met meer posterior tergieten. Hoewel minder variabel dan de vijfde en zesde abdominale tergieten, zijn de derde en vierde tergieten niet helemaal gepigmenteerd bij mannen, dus dit protocol kan zowel bij mannen als vrouwen worden toegepast. Desalniettemin, zoals hier getoond, kan het protocol worden gebruikt om pigmentatie in de vijfde en zesde buiktergieten bij vrouwen te meten. Bovendien moeten kleine wijzigingen van de scripts die gebruikt worden om de eigenschappen van het pigmentatieprofiel te extraheren, de methode toestaan ​​om de variatie in pigmentatie in een grote verscheidenheid aan andere te kwantificerenorganismen.