Transplantasjonen av kreftceller er et viktig verktøy for identifisering av kreftmekanismer og terapeutiske responser. Nåværende teknikker er avhengige av immunkompetente dyr. Her beskriver vi en metode for å transplantere zebrafisk-tumorceller til immunkompetente embryoer for langsiktig analyse av tumorcelleadferd og in vivo- medikamentresponser.
Tumorcelletransplantasjon er en viktig teknikk for å definere mekanismer som styrer kreftcelletilvekst, migrasjon og vertsrespons, samt å vurdere potensiell pasientrespons på terapi. Nåværende metoder er i stor grad avhengige av bruk av syngene eller immunforstyrrede dyr for å unngå avvisning av tumorgraft. Slike metoder krever bruk av spesifikke genetiske stammer som ofte forhindrer analyse av immunkumor-celleinteraksjoner og / eller er begrenset til spesifikke genetiske bakgrunner. En alternativ metode i sebrafisk utnytter et ufullstendig utviklet immunsystem i den embryonale hjernen før 3 dager, hvor tumorceller transplanteres til bruk i kortsiktige analyser ( dvs. 3 til 10 dager). Imidlertid forårsaker disse metodene vertdødlighet, som forhindrer den langsiktige studien av tumorcelleadferd og medikamentrespons. Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for den langsiktige ortototopiske transplantasjonen av zebrafisk hjerne tumorvev iTil den fjerde ventrikel av en 2-dagers ukjent kompetent sebrafisk. Denne metoden tillater: 1) langsiktig studie av tumorcelleadferd, som invasjon og formidling; 2) varig svulstrespons mot rusmidler; Og 3) re-transplantasjon av svulster for studier av tumorutvikling og / eller virkningen av forskjellige vertsgenetiske bakgrunner. Sammendrag, lar denne teknikken kreftforskere å vurdere engraftment, invasjon og vekst på fjerne steder, samt å utføre kjemiske skjermbilder og cellekonkurranseanalyser i mange måneder. Denne protokollen kan utvides til studier av andre svulst typer og kan brukes til å belyse mekanismer for kjemoresistens og metastase.
Transplantasjonen av tumorceller til immunkompromitterte dyr, spesielt mus-xenotransplantater, er en allment brukt teknikk som brukes til å studere mekanismer som styrer kreftcelleproliferasjon 1 , 2 , overlevelse, invasjon og metastase 3 , 4 , samt å gi en plattform For screening medikamenter 5 , 6 , 7 . Mer nylig har transplantasjonen av primære svulstprøver i immunkompromitterte mus blitt brukt til å generere pasient-avledede xenograftmodeller (PDX) for diagnostisk og preklinisk narkotika-screening, og er ryggraden i personlig medisin-initiativet 8 , 9 , 10 , 11 . Imidlertid viser signifikant bevis at modulering av immunsystemetStamme kan ha en dramatisk innvirkning på svulsteradferd og pasientutfall 12 , 13 . Dette har drevet redesignet av xenograft-baserte teknikker for å inkludere "humaniserte" mus, hvor immunsystemet til musen rekonstitueres ved samtransplantasjon av humane immunceller med tumorceller. Imidlertid er denne tilnærmingen fortsatt teknisk utfordrende, med variabel reproduserbarhet og toksisiteter forbundet med teknikken, i tillegg til den betydelige kostnaden 14 , 15 . Dermed er det nødvendig med nye transplantasjonsteknikker i immunkompetente dyr for å akselerere oppdagelsen av immun- og tumor-spesifikke mekanismer for kreftprogresjon og narkotika respons.
Sebrafisk er en alternativ dyremodell for studier av menneskelig kreft, med over 20 kreftmodeller etablert nå 16 , inkludert svært ondartet hjerne 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 og bukspyttkjertelcancer 21 , 22 , så vel som mange leukemier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . To egenskaper hos zebrafisksystemet gjør det spesielt egnet for kreftforskning: 1) Den optiske klarheten til gjennomsiktige dyr tillater direkte visualisering av kreftcelleadferdene ( dvs. spredning, overlevelse, invasjon og spredning) ved hjelp av enkle mikroskopiteknikker og 2) Kvinnenes sebrafisk kan produsere opptil 200 embryoer per dag, noe som gjør det mulig å raskt skille dyrnumre til genetisk eller narkotika-screening til en lav pris. I tillegg er kreftgenomene av sebrafisk og mennesker sterkt konserverte (inkludert onkogener og svulster-suppressor-gener)F "> 28, slik at mekanistiske og narkotikafunn raskt kan oversettes til pattedyrsystemer. Disse egenskapene gjør også sebrafisken en ideell dyremodell for transplantasjonsteknikker, som utnytter bildebehandling, skalerbarhet og lave kostnader for systemet.
Tidligere svulsttransplantasjonsstudier i immunforstyrret sebrafisk har gjort det lettere å identifisere selvfornyelsesevner, svulstproblemer og invasjon / spredning 11 , 29 . Kortsiktige studier av tumorcelleadferd kan utføres etter transplantasjon til γ-bestrålede voksne, hvis immunsystem effektivt undertrykkes for ~ 20 dager 11 , 30 . Behandlingen av voksen sebrafisk med dexametason undertrykker B- og T-celler i opptil 30 dager før avvisning skjer 31 . En annen mindre vanlig strategi benytter klonale sebrafiskstammerSom muliggjør langsiktige undersøkelser i en immunkompetent vert 32 . Imidlertid er bare et begrenset antall klonestammer generert og er vanskelig å opprettholde på grunn av lav fecunditet. I tillegg genereres de fleste etablerte sebrafisk-svulstmodeller i andre genetiske bakgrunner, slik at disse svulstene ikke kan transplanteres inn i klonestamlene uten å undertrykke immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyere tilnærminger for å forbedre langsiktige transplantasjonsstudier inkluderer utvikling av rag2 E450fs mutantlinjen , med kompromitterte B- og T-cellefunksjoner, som har blitt brukt til å transplantere flere kreftformer 35 , 36 . For å omgå kravet til klonale sebrafisk linjer eller en immunforstyrret vert, har flere grupper brukt tidlige embryoer ( dvs. > 72 hkOst-befruktning (hpf)) for human tumorcelletransplantasjon, da disse embryoer ennå ikke har utviklet et adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Imidlertid er disse metodene begrenset til kortsiktig analyse av tumorcelleadferd eller medikamentrespons (vanligvis mindre enn 2 uker) fordi de menneskelige kreftceller eller selve transplantasjonsteknikken dræper verten, hindrer langsiktige studier og re-transplantasjon.
Denne protokollen beskriver en modifisert embryonaltransplantasjonsmetode i lumen i den fjerde ventrikel i en 2-dagers post-befruktning (dpf) embryo-hjerne. Det minimerer toksisiteten til verten og kan kombineres med zebrafisk hjerne svulst modeller for langsiktig engraftment av tumorceller. Dermed er denne teknikken alLows for re-transplantasjon av svulstceller til nye verter over mange generasjoner, forenkling av fremtidige studier av tumor heterogenitet, verts / immunrespons, narkotika responser eller metastatisk potensial. Denne metoden er også enkel, effektiv og skalerbar, da opptil 300 transplantasjoner kan utføres av en enkelt bruker per dag, med opptil 90% engraftment. Dette gjør det mulig for rask utbredelse av enkelt primære svulster i hundrevis av embryoer ved 2 dpf for genetiske eller narkotika-screeningsprosjekter eller for direkte å visualisere hjerne-tumorcelleadferd i forskjellige vertsbakgrunner over mange måneder.
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv transplantasjonsanalyse som involverer injeksjon av zebrafisk-tumorceller i ventrikkelen i et 2-dpf-embryo som vil utvikle et fullt kompetent immunsystem. Så langt har zebrafisk CNS-PNET 17 og melanom (data ikke vist) blitt transplantert for langsiktige studier av tumorcelleadferd og invasjon. De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer å sikre riktig nåleborestørrelse og riktig tumorcellesuspensjon og tilstrekkelig bedøvende vertsembryoer. For hver enkelt forsker kan ytterligere optimalisering av denne teknikken omfatte justering av tumorcellekonsentrasjon, injeksjonstrykk og embryoorientering. I tillegg kan det være heterogenitet i viskositeten av suspensjoner som kommer fra forskjellige svulster, slik at forskjellige svulst typer kan være mer eller mindre vanskelige å suspendere og transplantere. Men ved å justere nålens borestørrelse og ved å bruke diffeLeiefortynninger av svulstesuspensjonen, det er mulig å overvinne vanskeligheter forbundet med tumorviskositeter.
Etter vår erfaring er de vanligste årsakene til sparsomme celler / inkonsekvente cellemasse i ventrikkelen som følger: 1) tumorcellesuspensjonen er for fortynnet; 2) nålens borestørrelse er for liten; 3) injeksjonstid og -trykk er for lavt; Og / eller 4) gjenværende vev ble ikke filtrert fra svulsten og innlagt i nålen. Når svulstcellesuspensjonen strømmer ut av ventrikkelen etter injeksjon, skyldes det sannsynligvis: 1) plassering av nålen mot gulvet i ventrikkelen; 2) høyt injeksjonstrykk og tid; Og / eller 3) en nålbore størrelse som er for stor. Lav overlevelse av transplanterte embryoer kan skyldes: 1) bedøvelse av embryoer i lengre tid; 2) forlater embryoer på injeksjonsplaten for å tørke; 3) injeksjon av luftbobler inn i ventrikkelen; Og / eller 4) piercing vitale organer, som hjernen ogHjerte, fordi nålen gikk gjennom ventrikkelen.
Tidligere metoder for tumortransplantasjon hos voksne eller embryonale sebrafiskhjerne stammer fra immunosuppresjon hos voksne (genetisk, farmakologisk eller via stråling) eller er begrenset til kortsiktige studier av humane eller musceller i embryoer 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . For eksempel kan musens hjerne-tumorer injiseres intranasalt i deksametason-immunsuppressiv, 30-dpf juvenil sebrafisk for bruk på kortvarige (~ 2 dager) prekliniske legemiddelanalyser 54 . Imidlertid er injeksjonsstedet i disse forsøkene skjult av skallen og hjernevævet og vil sannsynligvis resultere i skade på normalt hjernevæv, noe som reduserer vertslevbarhet og engraftmenteffektivitet. En annen nylig beskrevet metode involverer injeksjon av menneskelig gliobLastoma cellelinjer i midbrain regionen av zebrafish embryoer, som gjorde det mulig for kortsiktig analyse av vekst, invasjon og narkotika respons 43 . Igjen er det nøyaktige stedet for injeksjonsstedet variabelt og sannsynligvis skadet normalt vev. Dermed kompromitterer tidligere metoder for embryonale hjernetransplantasjoner ofte levedyktigheten av vertene, og begrenser disse studiene til kortsiktig analyse ( dvs. 2 til 14 dager), noe som medfører økt variasjon mellom individuelle injeksjoner på grunn av skjulte injeksjonssteder og hindrer langvarig injeksjon. Langsiktig analyse av celleadferd og rusmiddelrespons eller re-transplantasjon over flere generasjoner.
Metoden beskrevet her adresserer nåværende begrensninger i embryonale og immunforstyrrede transplantasjonsteknikker ved å tillate forskere: 1) reproduserbart injiseres på samme sted, med minimal skade på omgivende vev; 2) visualisere direkte injeksjonsstedet for å maksimereEngraftment effektivitet; 3) transplantere hundrevis av embryoer per dag; 4) la svulster vokse i immunkompetente dyr; 5) muliggjøre overvåking av tumorcelleadferd og holdbare legemiddelresponser over livet av sebrafisken; Og 6) tillate re-transplantasjon av svulster over mange generasjoner for potensielle studier på utviklingen av tumor eller mekanismer for tilbakefall av medisiner. Videre tillater denne protokollen forskere å utnytte noen sebrafiskgenotype til vurdering av vertsresponsen, inkludert forskjellige immunpopulasjoner. Disse egenskapene gjør denne metoden lett tilpassbar av alle laboratorier som allerede utfører standard mikroinjeksjoner i sebrafisk. Til slutt, mens denne metoden er ideell for ortopotopiske injeksjoner av zebrafisk hjerne svulster, kan transplantasjonen av andre svulst typer, som lever eller bukspyttkjertel, være viktigere enn immunkompetanse (for eksempel hvis en forsker studerer effekten av stromal Mikromiljø på tumorvekst). I dette scenariet, denNyutviklede, immundefekte zebrafiskmodeller kan være mer hensiktsmessige for å utføre ortotopiske tumortransplantasjoner 11 .
Denne protokollen har blitt brukt til å utføre tumorcellekonkurranseanalyser og å injisere dobbelt merkede svulster. En potensiell behandlingsstrategi for vurdering av effektiviteten av kjemiske forbindelser på tumorigenese, som involverer behandling av embryoer etter transplantasjon via tilsetning av legemidlet til vann, ble også diskutert. En metode for ex vivo behandling av tumorceller før transplantasjon ble også tidligere rapportert 17 . I tillegg er transplanterte svulster blitt samlet for flere runder av re-transplantasjon, som vil være gunstig for studier av tumorutvikling og kjemoresistens 17 . Foreløpig er prekliniske studier avhengig av musen xenografter for å vurdere effekten av potensielle forbindelser. Men disse studiene er tidkrevendeOg kostbart. Med tanke på den høye grad av bevaring av onkogene signalveier mellom sebrafisk og mennesker 28 , kan det forventes at denne metoden vil utfylle konvensjonelle mus- og humancellestudier for å muliggjøre raskere identifisering av effektive forbindelser inn i prekliniske og kliniske studier. Til slutt kan denne metoden vise seg å være nyttig for hurtig kjemisk screening av primære pasienttumorer, noe som ytterligere kunne drive det personlige medisinske initiativet. Imidlertid må forholdene for langvarig vekst av humane celler i sebrafisk (voksen eller embryo) fortsatt identifiseres.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de to korrekturleserne for gode forslag og forbedringer av manuskriptet. Vi takker også Huntsman Cancer Institute / University of Utah for husdyrhold og vedlikehold. Dette arbeidet ble finansiert av American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), et NIH-stipend (P30 CA042014 CRR-programmet), University of Utah Seed Grant og Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |