Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim
Summary
Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.
Abstract
CD8 T hücre kansere karşı mücadelede anahtar oyuncular vardır. CD8 T hücreleri tümör hücrelerini öldürmek için tümör girmeniz gerekir amacıyla, tümör microenvironment içinde göç ve yeterince tümör antijenleri için yanıt. 2-Foton mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme yaklaşımların son gelişmeler ve güçlü fare tümör modellerinin kullanımı bazı anti-tümör T hücre aktivitelerini düzenleyen mekanizmalar ışık. Oysa bu tür sistemlere değerli bilgiler vermişlerdir, onlar her zaman insani tepkilerin tahmin. İnsanda, alanında bizim bilgi çoğunlukla sabit tümör örnekleri vitro çalışmalar yanı sıra insan hastalar için bir açıklama gelir. Ancak, vitro modelleri karmaşık üç boyutlu tümör ortamın olmaması ve bu nedenle, in vivo eksik yaklaşımları T hücre faaliyetlerdir. Explanted dokudan yapılmış taze dilimleri co kültürlü çalışmaları ve hayvan modelleri arasında önemli bir bağlantı olarak hareket edebilir bir karmaşık çok hücreli tümör ortamı temsil eder. Aslında fare lenf düğümleri1 ‘ ayarlanır ve daha önce açıklanan bir Jüpiter makale2‘, bu yaklaşım hem kaplama3 hem de ikamet T hücreleri4dinamiklerini incelemek için insan tümörü şimdi aktarılması.
Burada, insan akciğer tümörü dilimleri hazırlanması, immunostaining ikamet CD8 T ve tümör hücrelerinin ve CD8 T lenfosit confocal mikroskobu kullanarak tümör microenvironment içinde izleme için bir protokol açıklanmıştır. Bu sistem benzersiz olduğunu için roman immünoterapi ajanlar tümör T hücre göç lehine ekran yerleştirilmiş.
Introduction
CD8 T hücreleri kansere karşı savaşta önemli bir rol oynar. Ancak, birçok süpresif mekanizmaları T lenfositler Malign hücreler öldürmesini engellemek. Geçen yıllar içinde T hücreleri frene serbest bırakmak birkaç umut verici stratejileri geliştirilmiş ve klinik5‘ te kullanılan. Bağışıklık denetim noktası hedefleme büyük ilgi korumak iki yaklaşım vardır antikorlar, anti-PD-1 ve aynı zamanda evlatlık T hücre tedavileri gibi. Yine de, son başarıları rağmen yalnızca bir alt kümesini hastalar bu terapiler6‘ dan yararlanabilirsiniz. Kanserli hastalarda direnç mekanizmaları daha etkin tedavileri geliştirmek için tanımlamak için büyük bir sorun olduğunu. Hangi romanda terapileri olabilir ile karakterize ve onların etki gücüne ve güvenliği için test modeli sistemleri geliştirmek için başka bir sorundur. Şimdiye kadar bu deneyleri en kötü tümör doku karmaşıklığı taklit vitro hücre kültür sistemleri üzerinde temel alır.
Ex vivo dokusu dilimlerin özgün doku microenvironment7korur gibi gelecek vaat eden bir teknik olduğunu. Yıllar boyunca, biz T lenfositler çeşitli dokularda dinamikleri izlemek için bu yaklaşım belirledik. Bizim sonuçları fluorescently etiketli T hücreleri fare lenf nodu dilimleri eklendi dokusu içine göç ve onların uygun microenvironmental ipuçları1,2‘ ye tepki gösterir. Benzer şekilde, insan akciğer tümörü dilimleri bindirilmiş T lenfositler hızla tümör stroma3işe. Bu tekniği kullanarak, hücre dışı matriks dağıtım ve geçiş içinde insan tümörler3,4T hücrelerinin denetlenmesinde önemli bir unsur olarak belirledik. Ex vivo davranışını saflaştırılmış ve kaplama T hücreleri mutlaka ikamet intratumoral T lenfositler davranışını yansıtmamaktadır çünkü son zamanlarda bu yaklaşım4iyileştirdiyseniz.
Burada ikamet T lenfositler taze insan akciğer tümörleri yapılan dilimleri içinde izlemek için bir protokol açıklayın. Endojen T hücreleri floresan antikor taze tümör dilimleri ve izlenmesi ile boyama (özel gömme ve katıştırılmış dokusunun vibratome kesit dahil olmak üzere) insan akciğer tümörü dilim hazırlanması farklı adımları oluşur Bu hücreler ile confocal mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan akciğer tümörü dilimleri ve ikamet CD8 T hücrelerinin dinamik davranış değerlendirilmesi confocal bir mikroskop kullanarak bir korunmuş tümör ortamında oluşturmak için basit, hızlı ve güçlü bir teknik açıklanmıştır. Bu bir arıtma kaplama T hücreleri üzerine fare lenf nodu dilimleri2izleme açıklar önceki Jüpiter yazı bir protokoldür.
Floresan boyalar ağartma floresein isothiocyanate ve phycoerythrin gibi ilk nesil boyalar ile özellikle dikkate alınmalıdır. Antikorların birleştiğinde-doğrudan belirgin bir photobleaching İki fotonlu mikroskop ile oluştu bulundu. Bunun tersi olarak, en az photobleaching confocal mikroskoplar özellikle son zamanlarda geliştirilen parlak floresan boyalar kullanılarak, fark edildi.
Antikorlar nispeten büyük moleküllerdir ve bu nedenle onların penetrasyon doku içine zor olabilir. Bu adımı kuluçka süresi artırarak geliştirilebilir. Buna ek olarak, daha küçük bir kullanım gibi doğrudan eşleşmiş reaktifler antikorlar temsil Fab parçaları iyi bir alternatif boyama.
Bu protokol için açıklanan tüm antikorlar önceden doğrulanmış ve parlak boyama4üretmek bilinmektedir. Bu nedenle, izotip denetimleri gerekli değildir. Bu yöntem diğer antikorları kullanarak değişiklik isterseniz, ancak, o zaman izotip kontrol antikor kullanımı önerilir.
Bu deneysel sistem bazı sınırlamalar sunar. Kesme yordamı CD8 T hücreleri, özellikle kesme yüzeye yakın davranışını etkileyebilir doku zarar verir. Buna ek olarak, bir dizi çözünür faktörler (örneğin kemokinler) T hücrelerinin geçiş kontrolünde enstrümantal kaybolabilir. Bu sorunların atlamak için bir yol mikron muhtemelen sağlıklı doku bölgelerinde yüzeyinden birkaç onlarca konumundaki T hücreleri izleme tarafından çok önemlidir. Yayımlanmış deneyler T hücreleri derin doku içinde lokalize kesmek yüzey4lokalize T hücreleri daha etkin bir şekilde geçirmek ortaya koyuyor. Biz-si olmak kullanılmış confocal mikroskoplar çalışmalarımız için ancak iki fotonlu mikroskoplar Uzaysal çözünürlük derinliği artacak yüksektir.
Bu yaklaşım nötr moleküller değildir fluorescently birleştiğinde antikorlar kullanımına dayanıyor. Tam boyutlu antikorlar normal T hücrelerinin farklı şekillerde çalışması etkilemeye yatkındır. İlk olarak, anti-CD8 antikorlar lenfosit sitoiskeleti etkileyen yeteneğine sahip bir hücre içi sinyal cascade tetikleyen tarafından T hücre göç değiştirebilirsiniz. İkinci olarak, anti-CD8 antikorlar CD8 ve MHC arasındaki etkileşimi modüle sınıf ı molekülleri, Antijen tanıma sürecinde önemli bir adım. Üçüncüsü, bozulmamış antikorlar tarafından birçok myeloid hücrelerin tümör içinde dağıtılmış ve bu nedenle duyarlı ifade Fc reseptörü non-spesifik sinyal artırmak için bağlayabilirsiniz. FC reseptörü ikamet myeloid hücre kültüründe hücreleri immünglobulin tümör ortamın içinde mevcut ile doygun çünkü biz muhtemelen böyle bir sorun bizim veri etkilenen hiçbir belirti vardır. Nitekim, serum ek etiketleme işlemi, ücretsiz Fc reseptörü, engellemek için bilinen bir işlem sırasında immün boyama değişmedi. Yine de, onların Fc bölgede antikorlar, Fc bölge, aynı zamanda antikorlar yoksun Fab parçaları mutasyona ve Devegiller elde edilen antikor parçaları8 ikamet hücreleri ile floresan tarayıcıları izlemek için diğer alternatif stratejileri temsil eder.
Son on yıl içinde birkaç model sistemleri geliştirilmiş ve T lenfositleri gerçek zamanlı görüntüleme için kullanılan. Bunlar, vitro hazırlıkları T hücreleri daha önce saflaştırılmış ve kültürlü ile antijen sunan hücreler içerir. Bu tür hazırlıklar Antijen tanıma ve yanıt verme mekanizmaları tanımlamalarındaki kayda değer ilerleme sağladı. Ancak, onlar doku ortamının karmaşıklığı eksikliği. Diğer hazırlıklar daha yakından bir yerel doku yapısı taklit kurulmuştur. Örnekler için üç boyutlu kollajen jel matrisler arıtılmış T hücreleri, yanı sıra kültür reaggregated doku parçaları T lenfositler dinamik davranışı teknolojileri9 Imaging floresan ile izlemek için kullanılan katıştırılmış . Bu sistemler bir mimari yerel doku yakın avantajı mevcut ama diğer önemli hücresel ve çözünür faktörler eksik. Fare, İki fotonlu intravital mikroskobu T hücreleri bir bozulmamış organ10gerçekten fizyolojik ortamında izlemek için istihdam edilmiştir. Ancak, böyle bir yaklaşım tuzağa düşürmek teknik olarak zordur. Ayrıca, fare modelleri insan fizyolojisi ile dikkate değer farklılıklar gösterir.
Bu protokol için açıklanan tekniği ortak kültür çalışmaları ve hayvan modelleri arasında önemli bir bağlantı olarak hareket için benzersiz olarak konumlandırılmış bir karmaşık çok hücreli tümör ortamı temsil eder.
Burada açıklanan protokol diğer hücreleri CD8 T lenfositler antikor oluşturulmuş olan daha hareket izlemek için de kullanılabilir. Ayrıca, teknik diğer insan ve fare tümörleri ve dokular için adapte edilebilir. Örneğin, biz gerçek zamanlı B hücreleri dinamikleri etiketli görüntü taze insan bademcikler bir anti-CD19 antikor ile mümkün olmuştur.
Bu protokol için açıklanan tekniği tedavi molekülleri T hücre hareketliliği dokularda kontrol ekranına sağlar. Kültür sisteminin erişilebilirlik bazı farmakolojik reaktifler uygulamak ve sonuçlarını T hücre göç test etmek için izin verir. Şimdi tümörler büyüyor, CD8 T hücreleri düşük geçiş sergi kabul edilir ve tümör hücreleri11kişilerle düşük. Önemlisi, T hücreleri tümör hücre bölgelerde kıt varlığı ile kötü bir sonucu ilişkilidir ve T hücre tabanlı kanserli hastalarda için direnç mekanizmaları olarak kabul edilir. Birden çok engeller T hücre tümörleri içinde göç dan sınırlama yoğun bir hücre dışı matriks de dahil olmak üzere tespit edilmiştir. Bu bağlamda, moleküller kötü huylu hücreleri ile etkileşim ve T hücre hareket geri yükleme olanağınız tanımlaması kanserli hastalarda önemli bir adım temsil eder. Bir önceki çalışmada bulduk kollajen collagenase, akut insan akciğer dilimlere uygulanan ile kısmi bozulma T hücrelerinin tümör hücreleri ile ilgili geliştirir.
Son olarak, olasılığı kadar birkaç gün7,12,13 için kültüründe insan tümör dilimleri tutmak için umut verici uygulamalar içinde dönem-in T hücreleri ve immünoterapi sunmaktadır.Ancak, uzun vadeli kültür sırasında modeli sisteminin istikrarı iyice değerlendirilmesi gereken bir önemli parametredir.
Taze ve sağlıklı doku almak iyi immunostaining kalite dilimlerle CD8 hücreleri, tümör hücreleri ve stromal öğeleri üretmek için kritik bir faktördür. Tümör biyopsi işlemeden önce 4 ° C’de tutmak çok önemlidir.
Dilimleri ince Forseps ile işlenmesi bu protokol içinde başka bir kritik adımı temsil etmektedir. Özel kolayca zarar görebilir gibi bu büyük bir özenle yapılmalıdır. Özel bir kesim çözümleri içeren antikor bir sızıntı kaynaklanan paslanmaz çelik çamaşır makinesi tarafından yapılan mühür tehlikeye sokacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mikroskoplar ile Pierre Bourdoncle ve Thomas Guilbert tesisin Cochin Imaging (Institut Cochin, Paris) tavsiye ve yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser kısmen Fransızca Ligue Nationale contre le CARPEM (kanser araştırmaları için kişiselleştirilmiş tıp), tarafından kanser gelen hibe Fondation de France ve Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik program kapsamında hibe tarafından desteklenen bir durumdu Sözleşme No 667980 (ayar).
Materials
| Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
| Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
| Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
| BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
| FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
| BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |
References
- Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner. J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes. J Vis Exp. (53), e3054 (2011).
- Salmon, H., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).
- Bougherara, H., et al. Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration. Front Immunol. 6, 500 (2015).
- Mandal, R., Chan, T. A. Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy. Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).
- Wolchok, J. D., et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Rashidian, M., et al. Noninvasive imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Joyce, J. A., Fearon, D. T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 348 (6230), 74-80 (2015).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).
