Ex Vivo Proyección de imagen de los linfocitos de T CD8 residente en Tumor de pulmón humano rebanadas utilizando Microscopía Confocal

Tumores humanos se obtuvieron con el acuerdo del Comité de ético francés y por la asistencia Publique-Hôpitaux de París (AP-HP) en aplicación al artículo L.1121-1 de la ley. Se obtuvo un consentimiento informado de los pacientes antes de la inclusión en el estudio. 1. obtención de tumores de pulmón humano Obtener muestras de tumor fresco pulmonar de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas estadio I-III, sometidos a una resección quirúrgica completa de los tumores de pulmón4. El tumor fresco no fija en tubo cónico de 15 mL que contiene helado Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) medio de transporte. Dejar reposar en hielo por 30 min hasta el paso 2.7.Nota: Cuando los tumores son recibidos en la tarde, ponerlos a 4 ° C durante la noche y al día siguiente del proceso. En este caso, complementar el Medio RPMI-1640 con 5% de suero bovino fetal (FBS). 2. agarosa incrustar y vibratome corte de tumores de pulmón humano Nota: Realice todos los pasos hasta 2.10 bajo condiciones estériles. Preparar solución de agarosa al 5% para incrustar mediante la disolución de agarosa de punto bajo punto de fusión de 1 g 20 ml estéril de solución salina con tampón fosfato (PBS) sin calcio y magnesio. El microondas esta solución hasta que la agarosa se disuelva completamente. Permita que la agarosa enfriar a 37 º C colocando la solución en una incubadora a 37 ° C durante 5 minutos. En una campana de cultivo de tejidos, preparar Medio RPMI-1640 completo (sin rojo de fenol) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 4 mM L y 1 x penicilina y estreptomicina. Añadir el Medio RPMI-1640 completo 1.1 mL por pozo a una placa de cultivo celular 6-bien y colocar un inserto de cultura celular de 30 mm en cada pozo. Coloque la placa a un lado en una incubadora a 37 ° C por 30 min hasta el paso 2.12. Lugar esteriliza las arandelas planas de acero inoxidable (diámetro interno de 5 mm, exterior de 10 mm de diámetro y 1 mm de espesor) en un plato de plástico de 35 mm con medio completo RPMI. Las arandelas se utilizará más para los anticuerpos se concentran en el segmento de vibratome corte. Colocar la biopsia del tumor en un plato de plástico de 10 cm y cortar el tumor con una cuchilla afilada en fragmentos de forma de cubo pequeño de aproximadamente 5 x 5 mm de longitud. Saque la agarosa de la incubadora y vierta la solución en un recipiente de plástico de 35 mm. Utilice un par de pinzas para transferir cuidadosamente los fragmentos de tumor a un trapo de tejido para retirar el exceso de medio. Inserte los fragmentos de la agarosa y colocar en la parte inferior del plato plástico. Deja el gel de agarosa en hielo por 5 min a solidificar. Una vez que solidifique la agarosa, invierta el plato plástico y espátula para liberar el gel entero. Utilice una cuchilla afilada para recortar el exceso agarosa que rodea el fragmento del tumor, dejando 3-5 mm de gel alrededor del tejido. Montar cada bloque de agarosa en el disco de muestra del vibratome con una gota de pegamento de tejido no tóxico butil cianoacrilato. Llene la bandeja de búfer de vibratome con PBS estéril fría e instale el disco del espécimen en la bandeja. Corte la agarosa había incrustada tejido en rodajas gruesas de 350 μm. Ajuste el vibratome a una velocidad de gama lenta (0.2-0.3 mm/s) y la frecuencia vibratoria en un rango medio (1,5 mm). Cuidadosamente con unas pinzas finas, recoger las rodajas de los tumores ya que se cortan y colocar plano en los insertos de la cultura de célula de una placa de 6 pozos (paso 2.3). Transferencia 1 rebanada en cada inserción. Tenga mucho cuidado al manipular las rebanadas ya que puede dañarse fácilmente. Utilice pinzas finas para colocar arandelas de acero inoxidable en cada segmento individual. Asegúrese de que las arandelas están bien posicionadas en la agarosa que rodea el tejido del tumor. Mantener la placa de cultivo a 37 ° C en un incubador humidificado 5% CO2 durante 10 minutos proceder a immunostaining. 3. el Immunostaining de residente células T CD8 y células tumorales Diluir los anticuerpos (concentración final 10 μg/mL) y el colorante nuclear (concentración final 1 μg/mL) en Medio RPMI-1640 sin rojo de fenol.Nota: Use junto fluorescencia anti-CD8 (IgG murino, clon SK1) y anti-EpCAM (molécula de adhesión celular epitelial) (murino IgG HEA-125) anticuerpos para etiquetar los linfocitos T CD8 y tumor de células epiteliales, respectivamente. Uso de anticuerpos fluorescente unida anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clon 5E10) etiqueta fibroblastos y células endoteliales activadas. Utilice 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para etiquetar el núcleo de las células con membrana plasmática comprometida con el fin de evaluar la viabilidad del tejido. Retire las placas de cultivo de la incubadora y utilice una pipeta para aspirar el líquido dentro de las arandelas de acero inoxidable. No retire el medio de 1,1 mL de RPMI-1640 situado bajo las inserciones de la cultura de célula (paso 2.3). Sin tocar la rebanada y utilizando una pipeta, añadir 40 μl de la solución que contiene los anticuerpos sobre cada rebanada de tumor. Incubar la placa a 37 ° C durante 15 min permitir anticuerpos. Con pinzas finas, retire las arandelas, las rebanadas y s dip 10 de ellos en Medio RPMI-1640 sin rojo de fenol. Coloque nuevamente las rebanadas en los insertos de la cultura de célula y añada una gota de rojo de fenol libre RPMI-1640 medio en cada segmento individual. Mantener la placa a 37 ° C durante 10 minutos proceder a la proyección de imagen. 4. la proyección de imagen y análisis de la migración de células T CD8 residente dentro de rebanadas de tumor de pulmón humano Nota: El microscopio confocal utilizado este protocolo es una vertical gira disco, equipado con un 25 x objetivo de inmersión de agua (25 x 0.95 N.A.). Preparación de la configuración del microscopio Ajuste la temperatura de la cámara de calor del microscopio a 37 ° C pocas horas antes de iniciar la sesión de proyección de imagen. Establecer un sistema de perfusión constantemente trozos de tumor con oxigenada (5% CO2, 95% O2) sin rojo fenol Medio RPMI (figura 1). Utilizar una bomba peristáltica para los medios de perfusión del flujo en la cámara de proyección de imagen y aspirar la solución a un matraz de recogida de residuos. Funcionar la bomba peristáltica para permitir la solución oxigenada al pasar por los tubos de la perfusión. Con pinzas finas, sacar la rodaja de la placa de 6 pozos y transferencia para el plato de plástico de 35 mm lleno de Medio RPMI sin rojo de fenol. Inmovilizar el segmento con un ancla de rebanada 19,7 mm diámetro con 2 mm espaciados-hilos de rosca. Coloque el plato Petri en la etapa de proyección de imagen del microscopio. Conecte las puntas de entrada y salida del sistema de perfusión. Encienda el sistema de perfusión y ajustar el caudal de los medios de comunicación a 0.8 mL/min. Bajar el objetivo de inmersión en agua a la rebanada. Se centran en la parte superior de la rodaja con luz de campo brillante.Con luz fluorescente apropiada, seleccione una región de interés que contiene las células T CD8, islotes tumor (positivos para EpCAM) y una zona de tejido conectador (positiva para CD90). Evaluar DAPI coloración en la superficie de corte y más profundo en el tejido para comprobar la viabilidad de las células dentro de la rebanada.Nota: Una porción saludable contiene sólo una minoría de células positivas DAPI a varias micras de la superficie de corte. Establecer una sesión de imágenes con las siguientes acciones. Dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente de los 3 fluoróforos, establecer el tiempo de exposición entre 50 a 800 ms y la intensidad del láser entre 20 a 40%. Seleccione el espesor z pila imagen dentro el segmento de tumor.Nota: Aquí, 10-12 aviones ópticos que abarca una profundidad total de 60-70 μm en la dimensión z fueron capturados. Seleccione la posición de inicio a aproximadamente 10 μm por debajo de las primeras células de T CD8 marcadas. Definir el intervalo de tiempo entre cada imagen z-stack entre 10 a 30 s y el tiempo de grabación total entre 10 a 30 min. Analizar migración de células T CD8 residente como se describe en la referencia4. Después de importar los datos a un software de seguimiento, crear lugares para cada célula T CD8 en el campo. Ajustar el diámetro de las células y el umbral de detección según en las células fluorescentes reflejadas. Inspeccionar las pistas y eliminar cualquier pista irrelevante por eliminarlos. Canciones correcto de conexión y desconexión de diferentes pistas y diferentes momentos de las mismas pistas. Exportar los datos (velocidad, longitud de desplazamiento de la pista) a un software de hoja de cálculo.