Ex Vivo Визуализация-резидентов CD8 Т-лимфоцитов в опухоли легких человека кусочки с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Этот протокол описывает метод для изображения резидентов проникновения опухоли CD8 Т-клеток помечены дневно спаренных антител в легкое человека опухоли фрагменты. Этот метод позволяет в реальном времени анализ CD8 T клетки миграции с помощью конфокальной микроскопии.
Abstract
CD8 Т-клеток являются ключевыми игроками в борьбе против рака. Чтобы CD8 Т-клеток убить раковые клетки, они должны вступить в опухоль мигрируют в пределах микроокружения опухоли и адекватно реагировать на опухолевые антигены. Последние разработки усовершенствованных тепловизионных подходов, таких как 2-Фотон микроскопии и использование моделей мощных мыши опухоли пролили свет на некоторые из механизмов, которые регулируют деятельность противоопухолевый Т-клеток. Такие системы предоставляют ценную информацию, в то время как они не всегда прогнозирования реакции человека. В человека наши знания в области главным образом приходит от описания образцов фиксированной опухоль от человека пациентов, а также в vitro исследования. Однако в пробирке модели отсутствуют сложные трехмерные опухоли окружение и, таким образом, являются неполными аппроксимации в естественных условиях деятельность Т-клеток. Ломтики свежих, сделанные из ткани, описаны представляют сложные многоклеточные опухоли среды, которая может служить важным связующим звеном между совместно культивируемых исследований и животных моделей. Первоначально в мышиных лимфатических узлов1 и описано в статье JoVE2, этот подход теперь было перенесено в человека опухоли для изучения динамики покрытием3 , а также резидентов клетки T4.
Здесь описывается протокол для подготовки легкое человека опухоли фрагменты, иммуноокрашивания-резидентов CD8 T и опухолевых клеток и отслеживания CD8 Т-лимфоцитов в пределах микроокружения опухоли, с помощью конфокальной микроскопии. Эта система является уникальной размещены на экран для агентов Роман иммунотерапия пользу миграции Т-клеток в опухоли.
Introduction
CD8 T клетки играют ключевую роль в битве против рака. Однако многие подавляющих механизмы предотвращения Т-лимфоцитов от убийства злокачественных клеток. За последние годы разработаны и использованы в клинике5несколько перспективных стратегий, которые тормозов на Т-клетки. Эти два подхода, которые сохраняют значительное внимание являются иммунные контрольно-пропускной пункт ориентация антител, таких как анти PD-1 и приемных T клеточной терапии. Тем не менее несмотря на недавние успехи, только подмножество пациентов выгоду от этих терапии6. Одной из основных задач заключается в выявлении механизмов сопротивления Рак иммунотерапия с целью разработки более эффективных методов лечения. Еще одна задача заключается в разработке типовых систем в котором Роман терапии можно охарактеризовать и проверены на их эффективность и безопасность. До настоящего времени большинство этих анализов основаны на культуру в vitro клетки систем, которые плохо имитировать сложности опухолевой ткани.
Ex vivo кусочки ткани является перспективной техники, как он сохраняет оригинальные ткани микроокружения7. С годами мы создали этот подход для отслеживания динамики Т-лимфоцитов в различных тканях. Наши результаты показывают, что дневно обозначенных Т-клеток, добавил на вершине мышиных Лимфоузел ломтики мигрируют в ткани и реагировать на их соответствующие сигналы microenvironmental1,2. Аналогичным образом Т-лимфоциты, накладывается на легкое человека опухоли фрагменты быстро набираются в опухоли стромы3. Используя эту технику, мы определили внеклеточная матрица как важный элемент контроля распределения и миграции Т-клеток в опухоли человека3,4. Потому что поведение ex vivo очищенный и покрытием Т-клетки не обязательно отражает поведение резидентов внутриопухолевых Т-лимфоцитов, недавно мы уточнили этот подход4.
Здесь мы описываем протокол для отслеживания резидентов Т-лимфоцитов в пределах ломтиками, сделанные из свежих легкое человека опухоли. Различные этапы состоят из подготовки легкое человека опухоли фрагменты (включая агарозы встраивание и vibratome секционирование встроенных ткани), окрашивание эндогенного Т-клеток с флуоресцентных антител в ломтики свежих опухоли и контроля за Эти клетки с конфокального микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан простой, быстрый и надежный метод для генерации легкое человека опухоли фрагменты и оценки динамического поведения-резидентов CD8 Т-клеток в среде сохранились опухоли с помощью конфокального микроскопа. Этот протокол является уточнение предыдущей статьи JoVE, которая описывает мониторинг покрытием Т-клеток на мышиных Лимфоузел ломтики2.
Особенно с первого поколения краски флуоресцеин Изотиоцианаты и фикоэритрин должны рассматриваться отбеливания флуоресцентных красителей. Мы обнаружили, что произносится Фотообесцвечивание непосредственно сочетании антител произошло с микроскопом двух фотонов. И наоборот минимальный Фотообесцвечивание был замечен с конфокальные микроскопы, особенно с помощью ярких флуоресцентных красителей, разработали недавно.
Антитела являются относительно большие молекулы, и поэтому их проникновения в ткани может быть трудно. Этот шаг можно повысить, увеличив время инкубации. Кроме того использование меньшего пятнать реагентов как непосредственно-в сочетании Fab фрагментов антитела представляет хорошей альтернативой.
Все антитела, указанных в настоящем протоколе были ранее проверены и известно, производят яркие окраски4. Таким образом изотипа элементы управления не являются обязательными. Однако если изменения в этот метод, с помощью других антител, использование isotype антитела управления настоятельно рекомендуется.
Эта экспериментальная система представляет некоторые ограничения. Процедура резки будет повредить ткани, которая может повлиять на поведение CD8 Т-клеток, особенно вблизи поверхности среза. Кроме того количество растворимых факторов (например, chemokines) важную роль в регулировании миграции Т-клетки могут быть потеряны. Одним из способов обойти эти проблемы является мониторинг Т-клеток, расположенных в нескольких десятков мкм от поверхности в регионах предположительно здоровой ткани. Опубликованные эксперименты показывают, что Т-клетки, локализованные глубоко в ткани мигрируют более активно, чем локализовано вблизи вырезать поверхности4Т-клеток. Мы использовали конфокальные микроскопы для нашего исследования, но вполне вероятно, что два фотона Микроскопы увеличит пространственное разрешение в глубину.
Этот подход основывается на использовании дневно в сочетании антител, которые не являются нейтральными молекулами. Полноразмерная антитела подвержены повлиять на нормальное функционирование клеток T различными способами. Во-первых антитела анти CD8 может изменить миграции Т-клеток, вызывая внутриклеточной сигнализации Каскад, способных затронуть цитоскелета лимфоцитов. Во-вторых, анти CD8 антител может модулировать взаимодействие между CD8 и MHC I класса молекул, важным шагом в процессе распознавания антигена. В-третьих, нетронутыми антитела можно привязать к Fc рецепторов, выраженные многими миелоидных клеток, распределенных в опухоли и поэтому подвержены увеличить неспецифичный сигнал. У нас есть никаких признаков того, что такая проблема затрагивает наши данные, вероятно потому, что рецепторы Fc-резидент миелоидных клеток в отличие от клеток в культуре, насыщены иммуноглобулинов в обстановке опухоли. Действительно добавлением сыворотки в процедуре маркировки, процесс, известный блокировать бесплатно Fc рецепторов, не изменить, иммуно окрашивание. Тем не менее Fab фрагментов антител, лишенный ФК региона, а также антитела мутировали в их регионе ФК и животноводческие, полученных антител фрагменты8 представляют другие альтернативные стратегии для отслеживания резидентов клетки с трасеров флуоресцентной.
За последние десятилетия несколько типовых систем разработаны и используются для реального времени изображений Т-лимфоцитов. К ним относятся препараты в vitro T клетки предварительно очищенный и культивировали с антиген представляющих клеток. Такие препараты позволили значительный прогресс в определении механизмов антигены и отзывчивость. Однако им не хватает сложность среды ткани. Были созданы другие препараты, что более тесно имитировать структуру родной ткани. Для примеров трехмерные коллаген гель матрицы в которых очищенная Т-клетки были внедрены, и культуры ткани, реагрегироваться, фрагменты были использованы для мониторинга динамического поведения Т-лимфоцитов с флуоресцентных изображений технологий9 . Эти системы представляют преимущества архитектуры недалеко от родной ткани, но им не хватает других важных клеточных и растворимых факторов. В мышь два Фотон прижизненной микроскопии был нанят отслеживать Т-клеток в поистине физиологической среде нетронутыми орган10. Однако такой подход является технически трудно настроить. Кроме того мышь модели показывают заметные различия с человеческой физиологии.
Метод, описанный в настоящем Протоколе представляет сложных многоклеточных опухоли среды, которая имеет уникальную возможность служить важным связующим звеном между исследования совместно культуры и Животные модели.
Протокол, описанные здесь, также может использоваться для отслеживания подвижности других клеток, чем CD8 Т-лимфоцитов, для которых были созданы антител. Кроме того техника может быть адаптирована к другим человека и мышиных опухолей и тканей. Например мы смогли изображение в реальном времени динамику клеток B помечены с анти CD19 антитела в свежей человеческой миндалин.
Метод, описанный в настоящем Протоколе позволяет экран для терапевтических молекул контроль моторики Т-клеток в тканях. Доступность системы культуры позволяет применять некоторые фармакологические реагентов и проверить их последствий миграции Т-клеток. Он теперь признается, что в растущей опухоли, CD8 Т-клетки exhibit низкий миграции и сокращение контактов с опухолевых клеток11. Важно отметить, что скудные присутствие Т-клеток в опухоли ячейки регионов связан с плохой результат и считается одним из механизмов сопротивления на основе Т клеток рака иммунотерапия. Были выявлены несколько препятствий, ограничивающих Т-клетки мигрировать в опухоли включая плотной внеклеточного матрикса. В этой связи выявление молекулы способны восстановить подвижность Т-клеток и взаимодействие с злокачественных клеток представляет собой важный шаг в Рак иммунотерапия. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что их частичную деградацию коллагена с коллагеназы, остро применяется к фрагментам легкое человека, улучшает контакт Т-клеток с опухолевых клеток.
Наконец возможность держать человека опухоли фрагменты в культуре для до7,12,несколько дней13 предлагает ряд перспективных приложений в срок Т-клеток и иммунотерапии.Однако стабильность модель системы в долгосрочной перспективе культуры является важным параметром, который необходимо тщательно оценивать.
Получение свежей и здоровой ткани является решающим фактором для получения фрагментов качества с хорошим иммуноокрашивания CD8 клетки, клетки опухоли, и стромальных элементов. Сохраняя биопсия опухоли на 4 ° C до обработки имеет решающее значение.
Обработка срезов с тонкой щипцами представляет собой еще один важный шаг в рамках настоящего Протокола. Это следует выполнять с большой осторожностью, как агарозы могут быть легко повреждены. Вырезать в агарозном скомпрометирует печать, сделанное шайбы из нержавеющей стали, что приводит к утечке антитела, содержащие решения.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить Пьер Bourdoncle и Томас Гильбер Кочин Imaging фонда (Institut Кочин, Париж) для консультаций и помощи с микроскопы. Эта работа была поддержана в части субсидий от le национальной французской лиги против рака, CARPEM (рак исследований для персонализированной медицины), Фондасьон де Франс и программой Европейского союза Horizon 2020 исследований и инноваций Грант Соглашение No 667980 (карат).
Materials
| Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
| Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
| Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
| BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
| FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
| BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |
References
- Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner. J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes. J Vis Exp. (53), e3054 (2011).
- Salmon, H., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).
- Bougherara, H., et al. Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration. Front Immunol. 6, 500 (2015).
- Mandal, R., Chan, T. A. Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy. Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).
- Wolchok, J. D., et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Rashidian, M., et al. Noninvasive imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Joyce, J. A., Fearon, D. T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 348 (6230), 74-80 (2015).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).
