Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

Tumores humanos foram obtidos com o acordo do Comité francês de ético e pela assistência Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) no aplicativo com o artigo L.1121-1, da lei francesa. Obteve-se um termo de consentimento informado dos pacientes antes da inclusão no estudo. 1. obtenção de tumores de pulmão humano Obter amostras de tumor de pulmão frescas de pacientes com câncer de pulmão de células não-pequenas estágio-III, que foi submetido a uma ressecção cirúrgica completa de seus tumores de pulmão4. Transporte o tumor fresco não fixa em tubo cônico de 15 mL contendo meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) gelado. Reserve no gelo por 30 min até passo 2.7.Nota: Quando os tumores são recebidos no período do tarde, colocá-los em 4 ° C durante a noite e o processo no dia seguinte. Neste caso, complementar a mídia RPMI-1640 com 5% de soro fetal bovino (FBS). 2. Agarose incorporação e vibratome de corte de tumores de pulmão humano Nota: Execute todas as etapas até 2.10 sob condições estéreis. Prepare a solução de agarose de 5% para incorporação pela dissolução de 1 g agarose de ponto baixo ponto de fusão em 20 mL estéril de tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Microondas esta solução até a agarose é completamente dissolvido. Permitir que a agarose esfriar a 37 ° C, colocando a solução em uma incubadora a 37 ° C por 5 min. Em uma capa de cultura de tecidos, prepare meio RPMI-1640 completo (sem vermelho de fenol) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), 4 mM L glutamina e 1x penicilina e estreptomicina. Adicionar meio RPMI-1640 completo de 1,1 mL por alvéolo para uma placa de cultura de células de 6-poços e coloque uma inserção de cultura de célula de 30 mm em cada poço. Reserve a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min até passo 2.12. Lugar esterilizado arruelas planas de aço inoxidável (diâmetro interno de 5 mm, fora de 10 mm de diâmetro e espessura de 1 mm) em um prato de plástico-35mm preenchido com completo meio RPMI. Anilhas serão mais usadas para concentrar os anticorpos a fatia de vibratome de corte. Coloque a biópsia do tumor em um prato de plástico de 10 cm e corte o tumor com uma lâmina afiada em fragmentos de forma cubo pequeno de aproximadamente 5 x 5 mm de comprimento. Retire o agarose da incubadora e despeje a solução em um prato de plástico-35mm. Use um par de pinças para transferir com cuidado, os fragmentos do tumor para uma limpeza de tecido para retirar o excesso do meio. Inserir os fragmentos o agarose e posicioná-los no fundo do prato plástico. Deixe o gel de agarose no gelo por 5 min solidificar. Uma vez que a agarose solidifica, inverta o prato plástico e use uma espátula para liberar o gel todo. Use uma lâmina afiada para aparar o excesso agarose cercam o fragmento do tumor, deixando de 3 a 5 mm de gel ao redor do tecido. Monte cada bloco de agarose no disco espécime do vibratome com uma gota de cola de tecido de cianoacrilato butílico de tóxicos. Encha a bandeja de tampão vibratome com PBS estéril gelada e instalar o disco de amostra na bandeja. Corte o agarose incorporado tecido em 350 µm de espessura. Ajustar as definições de vibratome a uma velocidade lenta de gama (0.2-0.3 mm/s) e a frequência de vibração em um intervalo médio (1,5 mm). Usando a pinça fina, cuidadosamente colete as fatias de tumores, como eles estão sendo cortados e colocá-los horizontalmente para as inserções de cultura de células de uma placa de 6 (passo 2.3). Transferi 1 fatia em cada inserção. Use muito cuidado ao manusear as fatias como eles podem ser facilmente danificados. Use pinça fina para colocar arruelas de aço inoxidável em cada fatia individual. Certifique-se que as anilhas estão bem posicionadas no tecido do tumor o agarose. Manter a placa de cultura a 37 ° C numa incubadora umidificado 5% CO2 durante 10 min. proceder de imunocoloração. 3. imunocoloração de residentes células T CD8 e células tumorais Dilua os anticorpos (concentração final de 10 µ g/mL) e o corante nuclear (concentração final de 1 µ g/mL) em mídia RPMI 1640 sem vermelho de fenol.Nota: Usar fluorescente acoplados anti-CD8 (IgG murino, clonar SK1) e anti-EpCAM (molécula de adesão de células epiteliais) (murino IgG HEA-125) anticorpos para rotular os linfócitos T CD8 e tumor células epiteliais, respectivamente. Use anticorpos acoplados fluorescente anti-CD90/Thy1 (IgG murino, clone 5E10) rótulo fibroblastos e células endoteliais ativadas. Use 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para rotular o núcleo das células com uma membrana de plasma comprometida a fim de avaliar a viabilidade do tecido. Remover as placas de cultura de incubadora e usar uma pipeta para aspirar qualquer líquido dentro as anilhas de aço inoxidável. Não remova a mídia de 1,1 mL de RPMI-1640 colocada sob as inserções de cultura celular (passo 2.3). Sem tocar a fatia e utilize uma ponta de pipeta, adicione 40 µ l da solução que contém os anticorpos para cada fatia de tumor. Incube a placa a 37 ° C por 15 min permitir que a mancha do anticorpo. Com a pinça fina, retire as anilhas, tire as fatias e mergulho os 10 s em RPMI-1640 mídia sem vermelho de fenol. Coloque de volta as fatias para as inserções de cultura celular e adicionar uma gota de vermelho de fenol-livre RPMI-1640 médio em cada fatia individual. Manter a placa a 37 ° C por 10 min. proceder à imagem. 4. imaging e analisando a migração de células T CD8 residente dentro de fatias de tumor de pulmão humano Nota: O microscópio confocal utilizado neste protocolo é uma verticalidade girando o disco equipado com um 25 x objetivo de imersão de água (25 x / 0.95 N.A.). Preparando a instalação do microscópio Defina a temperatura da câmara de calor microscópio a 37 ° C, algumas horas antes de iniciar a sessão de imagens. Configurar um sistema para perfundir constantemente fatias do tumor com oxigenada (5% CO2, 95% O2) meio RPMI de vermelho de fenol-livre (Figura 1). Use uma bomba peristáltica para fluxo de mídia a perfusão na câmara de imagens e de aspirar a solução para um balão de recolha de resíduos. Execute a bomba peristáltica para permitir que a solução oxigenada para passar os tubos de perfusão. Com a pinça fina, retire a fatia da placa de 6 e transferência para o prato de plástico-35mm encheu de vermelho de fenol-livre médio RPMI. Imobilize a fatia com uma âncora de fatia 19,7 mm de diâmetro com 2 mm espaçadas-tópicos. Coloque o prato de Petri no palco de imagem do microscópio. Conecte as pontas de entrada e saída do sistema de perfusão. Ligue o sistema de perfusão e definir a taxa de fluxo de mídia de 0,8 mL/min. Baixe o objectivo da água-imersão a fatia. Concentre-se no topo a fatia com luz de campo brilhante.Com luz fluorescente apropriado, selecione uma região de interesse que contém células T CD8, ilhotas de tumor (positivas para EpCAM) e uma área de estroma (positiva para CD90). Verificar a viabilidade de células dentro da fatia, avaliando DAPI mancha na superfície de corte e mais profunda no tecido.Nota: Uma fatia saudável contém apenas uma minoria de células positivas DAPI a vários mícrons de superfície de corte. Defina uma sessão de imagens com as seguintes ações. Dependendo da intensidade do sinal fluorescente dos 3 fluorophores, defina o tempo de exposição entre 50 a 800 ms e a intensidade do laser entre 20 a 40%. Selecione a espessura de pilha de z a imagem dentro da fatia de tumor.Nota: 10-12 aviões ópticos abrangendo uma profundidade total de 60-70 µm na dimensão z aqui, foram capturados. Selecione a posição inicial em aproximadamente 10 µm abaixo as primeiras células T CD8 rotuladas. Definir o intervalo de tempo entre cada imagem de z-pilha entre 10 a 30 s e o tempo de gravação total entre 10 a 30 min. Analise a migração de células T CD8 residente conforme descrito na referência4. Depois de importar os dados para um software de rastreamento, crie pontos para cada célula T CD8 no campo. Ajuste o diâmetro das células e o limite de deteção de acordo sobre as células fluorescentes imagens. Inspecione as faixas e remover qualquer faixa irrelevante por excluí-los. Corretas trilhas conectando e desconectando faixas diferentes e pontos de tempo diferentes das mesmas faixas. Exporte os dados (faixa de velocidade, faixa de comprimento de deslocamento) para um software de planilha eletrônica.