Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

ひと腫瘍は、フランスの法律の記事 L.1121-1 アプリケーションで支援パブリックメソッド-Hôpitaux ・ ド ・ パリ (AP HP)、フランスの倫理委員会の合意が得られました。書面によるインフォームド コンセントは研究の包含の前に患者から得られました。 1. 人間の肺腫瘍の取得 4肺腫瘍の完全な外科的切除を受けたステージ – III 非小細胞肺癌患者から新鮮な肺腫瘍のサンプルを取得します。 冷たいロズウェル パーク記念研究所 (RPMI 1640) 媒体を含んでいる 15 mL の円錐管に非固定新鮮な腫瘍を輸送します。手順 2.7 まで氷上で 30 分間おきます。注: 腫瘍は午後に受け取ったら、4 ° C 夜間、プロセス次の日にそれらを配置します。この場合、5% ウシ胎児血清 (FBS) に RPMI 1640 メディアを補足します。 2 アガロースを埋め込むとひと肺腫瘍の vibratome スライス 注: は、無菌条件下で 2.10 まですべての手順を実行します。 20 mL 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) カルシウムとマグネシウムなしの 1 g の低融点のポイント アガロースを溶解して埋め込むため 5% アガロース溶液を準備します。このソリューションを電子レンジ、アガロースを完全に溶解するまで。37 ° C で 5 分間 37 ° C でインキュベーターでソリューションを配置することによって冷却する agarose を許可します。 ティッシュ文化フードで完全な RPMI 1640 含む培地 (フェノールレッド) なし 10% 牛胎児血清 (FBS)、4 mM L グルタミン x ペニシリンとストレプトマイシン 1 を準備します。 6 も細胞培養プレートによくあたり 1.1 mL 完全 RPMI 1640 培地を追加し、各ウェルに 30 mm 細胞培養インサートを配置します。2.12 のステップまでプレートを 37 ° C で 30 分間、インキュベーターに置いておきます。 場所は、35 mm のプラスチックの皿 RPMI 完全培地でいっぱいでステンレス平ワッシャー (内径 5 mm、直径 10 mm、厚さ 1 mm) を滅菌.洗濯機は、さらに vibratome カット スライスに抗体を集中する使用されます。 腫瘍生検を 10 cm プラスチック皿に置き、約 5 × 5 mm の小さなキューブ形断片に鋭い刃を持つ腫瘍を切った。 インキュベーターからアガロースを取るし、35 mm のプラスチックの皿に溶液を注ぐ。 慎重に媒体の過剰を削除するのに組織ワイプに腫瘍フラグメントを転送するためには、鉗子のペアを使用します。Agarose にフラグメントを挿入し、プラスチックの皿の下部にそれらを配置します。Agarose のゲルのまま固めるため 5 分間氷の上。 Agarose を確固たるもの、一度プラスチックの皿を反転し、ヘラを使用して全体のゲルを解放します。 周囲の周囲の組織のゲルの 3 ~ 5 mm を残して腫瘍フラグメント過剰アガロースをトリミングするのにには、鋭い刃を使用します。 非毒性ブチル シアノアクリ レート系組織接着剤のドロップで、vibratome の試料ディスク上各アガロース ブロックをマウントします。滅菌の氷冷 PBS の vibratome バッファー トレイを入力し、試料ディスクをトレイにインストールします。 Agarose のカットには、350 μ m の厚さのスライスに組織が埋め込まれています。低速の範囲の速度で vibratome 設定を調整 (0.2-0.3 mm/s) と中距離 (1.5 mm) の振動数。 カットされているフラット 6 ウェル プレート (ステップ 2.3) のセルの文化挿入に配置腫瘍スライスを収集微細鉗子を使用して、慎重に。各挿入の 1 スライスを転送します。彼らは簡単に破損することができますスライスを処理するときは、細心の注意を使用します。 微細鉗子を使用すると、各スライスごとにステンレス製のワッシャーを配置します。洗濯機がよく agarose の周囲の腫瘍組織に配置されていることを確認します。 37 ° c 10 分進む免疫染色のための 5% CO2加湿インキュベーターで培養プレートを維持します。 3. 常駐 CD8 T 細胞と腫瘍細胞の免疫染色 (最終濃度 10 μ G/ml) 抗体と RPMI 1640 メディアのフェノールレッドなし核染料 (最終濃度 1 μ g/mL) を希釈します。注: 使用蛍光結合抗 CD8 (マウス IgG、SK1 のクローン) と反 EpCAM (上皮細胞接着分子) (マウスの IgG ょん-125) それぞれ cd8 陽性 T リンパ球と腫瘍上皮細胞をラベルする抗体。ラベル線維芽細胞と血管内皮細胞の活性を蛍光結合抗-CD90/Thy1 (マウス IgG、クローン 5E10) 抗体を使用します。4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を使用して組織の実行可能性を評価するために危険にさらされた細胞膜と細胞の核にラベルを付ける。 インキュベーターから培養皿を外し、ステンレス製のワッシャーの内側任意の液体を吸引ピペットを使用します。細胞培養インサート (ステップ 2.3) 下に置かれる 1.1 mL RPMI 1640 メディアを取り外さないでください。 スライスに触れて、ピペット チップを使用せず、腫瘍の各スライス上に抗体溶液 40 μ L を追加します。 抗体の汚損を許可する 15 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。 微細鉗子でワッシャーを削除、スライスおよび RPMI 1640 メディアのフェノールレッドなしディップそれら 10 s を取り出します。戻って細胞培養インサートの上にスライスを配置し、フェノールレッド フリー RPMI 1640 のドロップを追加各スライスごとに中。イメージングを 37 ° C 10 分続行でプレートを維持します。 4. イメージングおよびひと肺腫瘍スライス内常駐 CD8 T 細胞の遊走を分析 注: このプロトコルで使用されている共焦点顕微鏡は、水浸対物レンズ × 25 装備ディスクを回転直立 (25 x/0.95 エヌ ・ エイ)。 顕微鏡のセットアップの準備 顕微鏡による蓄熱体の温度 37 ° C でイメージング セッションを開始する前に、いくつかの時間を設定します。 常に腫瘍のスライスを灌流するシステム設定酸素 (5% CO295% O2) フェノールレッド フリー RPMI 培地 (図 1)。蠕動ポンプを使用してイメージングの商工会議所に灌流メディアを流れ、廃棄物収集フラスコにソリューションを吸引します。 灌流管を通過する酸素のソリューションを許可する蠕動性ポンプを実行します。 微細鉗子で 6 ウェル プレートと 35 mm のプラスチックの皿にはフェノールレッド RPMI 培満ちて転送からスライスを取り出してください。2 mm 間隔のスレッドで 19.7 mm 直径スライス アンカーでスライスを固定します。ペトリ皿を顕微鏡のイメージングのステージに配置します。灌流システムの入口と出口の先端に接続します。灌流システムをオンにし、メディア流量を 0.8 mL/分に設定します。 スライスに水浸対物レンズを下げます。明視野光とスライスの上に焦点を当てます。適切な蛍光灯で、CD8 T 細胞、腫瘍島 (EpCAM 陽性) と (CD90 の肯定的な) の間質領域を含む領域を選択します。DAPI 染色切断面より深い組織に評価を行い、スライス内の細胞の生存率を確認してください。注: 健康的なスライスには、切断面から数ミクロンの DAPI 陽性細胞の少数だけが含まれています。 次のアクションで撮像セッションを設定します。 3 蛍光物質の蛍光信号の強さに応じて 50 に 800 ms とレーザー強度 20 ~ 40% 間の露光時間を設定します。 腫瘍スライス内のイメージを残しスタックを選択します。注: ここでは、z 軸で 60-70 μ m の深さの合計にまたがる 10-12 光面を捕獲しました。 最初のラベルの付いた CD8 T 細胞の下約 10 μ m で開始位置を選択します。 10-30 の間各 z スタック画像間の時間間隔を定義する s と 10 〜 30 分間合計録画時間。 参考資料4の説明に従って住民 CD8 T 細胞の移動を分析します。 データをトラッキング ソフトウェアにインポートすると、フィールドに各 CD8 T 細胞のためのスポットを作成します。細胞の直径やイメージの蛍光細胞によると検出のしきい値を調整します。 トラックを検査し、それらを削除することによって任意の無関係なトラックを削除します。接続し、別のトラックと同じトラックの別の時点の取り外しによって正しいトラック。(トラックの速度、トラック変位の長さ) のデータを表計算ソフトにエクスポートします。