לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

גידולים אנושיים התקבלו עם ההסכם של הוועדה האתית הצרפתי ועל ידי של סיוע Publique-Hôpitaux פריז (AP-HP) ביישום עם המאמר L.1121-1 של החוק הצרפתי. הסכמה מדעת בכתב הושג מן המטופלים לפני ההכללה במחקר. 1. קבלת גידולים אמבריולוגיה להשיג דגימות הגידול ריאות טריים של חולים עם סרטן ריאות שאינם קטנים התא שלב I-III, שעברו כריתה כירורגית מלאה של גידולים שלהם ריאות4. תחבורה הגידול טרי שאינו קבוע בצינור חרוט 15 מ”ל המכילה קרח בינוני רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI 1640). להפריש על קרח למשך 30 דקות עד שלב 2.7.הערה: כאשר גידולים מתקבלים בשעות אחר הצהריים, למקם אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ותהליך למחרת. במקרה זה, תוספת התקשורת RPMI-1640 עם 5% סרום שור עוברית (FBS). 2. Agarose הטבעה וחלוקת vibratome של גידולים אמבריולוגיה הערה: בצע את כל השלבים עד 2.10 בתנאים סטריליים. להכין 5% agarose פתרון הטבעה על ידי המסת 1 g התכה נמוכה נקודת agarose ב- 20 מ ל סטרילי של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא סידן ומגנזיום. מיקרוגל פתרון זה עד agarose זה התפרקה לחלוטין. אפשר את agarose להתקרר ב 37 מעלות צלזיוס על ידי הצבת הפתרון באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. בשכונה תרביות רקמה, להכין מלא RPMI-1640 בינונית (ללא פנול אדום) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS), גלוטמין 4 מ מ L ו- 1 x פניצילין, סטרפטומיצין. להוסיף 1.1 mL בינוני RPMI-1640 מלאה בכל טוב צלחת תרבות 6-ובכן תא ולמקם הוספה תרבות של 30 מ מ תא מכל קידוח. להפריש את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שלב 2.12. המקום מעוקר שיבות שטוחות פלדת אל-חלד (הקוטר הפנימי של 5 מ מ, מחוץ בקוטר של 10 מ”מ, עובי 1 מ”מ) בצלחת פלסטיק 35 מ מ מלא בינוני מלא RPMI. דיסקיות ישמש עוד יותר להתרכז הנוגדנים הפרוסה vibratome-קאט. מקם את הביופסיה הגידול בצלחת פלסטיק 10 ס מ וחותכים את הגידול עם סכין חדה לחלקים צורה קובייה קטנה של 5 x 5 מ מ אורך. להוציא את agarose מן החממה ויוצקים את הפתרון לתוך צלחת פלסטיק 35 מ מ. השתמש זוג מלקחיים להעביר בזהירות השברים גידול רקמות מחיקה כדי להסיר את עודף של מדיום. להוסיף שברי agarose ומקם אותם בתחתית קערה מפלסטיק. השארתי את הג’ל agarose קרח במשך 5 דקות כדי לחזק. ברגע agarose מתמצק, היפוך קערה פלסטיק ולהשתמש מרית לשחרר את הג’ל כולו. השתמש סכין חדה לחתוך את agarose עודף השבר הגידול, להשאיר 3-5 מ מ ג’ל סביב הרקמה שמסביב. הר כל בלוק agarose על הדיסק הדגימה של vibratome עם טיפת רעיל בוטיל cyanoacrylate רקמות דבק. למלא את המגש מאגר vibratome סטרילי PBS קר כקרח, להתקין את הדיסק הדגימה במגש. לחתוך agarose מוטבע רקמות לפרוסות עבות מיקרומטר 350. התאם את ההגדרות vibratome במהירות איטית טווח (0.2-0.3 מ מ/s) ותדירות רטט בטווח בינוני (1.5 מ מ). בזהירות בעזרת מלקחיים בסדר, לאסוף את הפרוסות גידולים כפי שהם נקטעים ולמקם אותם בחוזקה הכיסויים התרבות התא של צלחת 6-טוב (שלב 2.3). העבר 1 פרוסה על כל הוספה. השתמש בקפידה רבה בעת טיפול פרוסות כפי שהם יכול להיפגע בקלות. השתמש בסדר מלקחיים למקום דיסקיות נירוסטה על כל פרוסה בודדים. ודא דיסקיות ממוקמות היטב על agarose המקיפים את רקמת הגידול. לשמור על לוח תרבות-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 humidified החממה במשך 10 דקות להמשיך כדי immunostaining. 3. Immunostaining של תאי CD8 T תושב ותאים סרטניים לדלל הנוגדנים (הריכוז הסופי 10 µg/mL) וצבע את הגרעין (ריכוז סופי 1 µg/mL) בתקשורת RPMI-1640 ללא פנול אדום.הערה: השתמש מצמידים fluorescently anti-CD8 (מאתר IgG, לשבט SK1) ו- anti-EpCAM (תאים אפיתל אדהזיה מולקולה) (מאתר אג האה-125) נוגדנים כדי לתייג לימפוציטים מסוג CD8 T, גידול תאי אפיתל, בהתאמה. השתמש מצמידים fluorescently אנטי-CD90/Thy1 (מאתר IgG, שיבוט 5E10) נוגדנים כדי תווית fibroblasts ותאי אנדותל מופעל. השתמש 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) לתייג את הגרעין של תאים עם קרום פלזמה פרוץ כדי להעריך את יכולת הקיום של רקמות. להסיר את הלוחות תרבות מן החממה ולהשתמש פיפטה לרוקן כל נוזל בתוך הדיסקיות פלדת אל-חלד. אל תסיר את המדיה 1.1 mL RPMI-1640 תחת השרוול התרבות התא (שלב 2.3). בלי לגעת הפרוסה ושימוש טיפ פיפטה, להוסיף µL 40 של הפתרון המכיל את הנוגדנים על כל פרוסה הגידול. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לאפשר נוגדן מכתים. עם מלקחיים בסדר, להסיר את הדיסקיות, להוציא פרוסות, ו- s לטבול אותם 10 RPMI-1640 מדיה ללא פנול אדום. מניחים בחזרה את הפרוסות על גבי השרוול התרבות תאים, להוסיף טיפה של פנול אדום ללא RPMI-1640 בינונית על כל פרוסה בודדים. לשמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות להמשיך כדי הדמיה. 4. הדמיה וניתוח תושב נדידת תאים CD8 T בתוך פרוסות הגידול אמבריולוגיה הערה: מיקרוסקופ קונפוקלי בשימוש פרוטוקול זה הוא ישר ספינינג דיסק מצויד של 25 x המטרה טבילה במים (25 x / 0.95 נ. א). הכנת ההתקנה מיקרוסקופ לקבוע את הטמפרטורה של החום-התא מיקרוסקופ 37 ° C מספר שעות לפני תחילת ההפעלה הדמיה. הגדרת מערכת ללא הרף perfuse הגידול פרוסות עם חמצן (5% CO2, 95% O2) ללא פנול אדום בינוני RPMI (איור 1). השתמש משאבה סחרור לזרום התקשורת זלוף אל החדר הדמיה לרוקן את הפתרון בקבוקון ומפקחת. הפעל את משאבת סחרור כדי לאפשר את הפתרון מחומצן ללכת דרך הצינורות זלוף. עם מלקחיים בסדר, תוציא את הפרוסה צלחת 6-ובכן, העברת אותו לצלחת פלסטיק של 35 מ מ מלא ללא פנול אדום בינוני RPMI. לשתק את הפרוסה עם עוגן פרוסה 19.7 mm בקוטר עם 2 מ”מ במרווח-חוטים. במקום הפטרי על הבמה הדמיה במיקרוסקופ. לחבר את הטיפים כניסת ו עודפים של מערכת זלוף. להפעיל את המערכת זלוף ולהגדיר את קצב זרימת מדיה 0.8 mL/min. . תוריד את המטרה טבילה במים כדי הפרוסה. פוקוס על הפרוסה עם אור בהיר שדה.באמצעות אור ניאון המתאים, בחר אזור עניין זה מכיל תאים CD8 T, הגידול איים קטנים (חיובי עבור EpCAM), אזור משתית (חיובי עבור CD90). בדיקת הכדאיות של תאים בתוך הפרוסה על-ידי הערכת דאפי מכתימים על פני לחתוך יותר ויותר עמוק לתוך הרקמה.הערה: פרוסה בריא מכיל רק מיעוט של דאפי תאים חיוביים על מספר מיקרונים מהמשטח לחתוך. הגדר הפעלה של הדמיה עם הפעולות הבאות. בהתאם עוצמת האות פלורסנט של fluorophores 3, הגדר את זמן החשיפה בין 50 ל 800 ms ועוצמת לייזר בין 20-40%. בחר את עובי מחסנית z כדי התמונה בתוך הפרוסה הגידול.הערה: כאן, 10-12 מטוסי אופטיים פורש לעומק סך של 60-70 מיקרומטר בממד z נלכדו. בחר את מיקום ההתחלה כ 10 מיקרומטר מתחת תאי CD8 T שכותרתו הראשון. להגדיר את מרווח הזמן בין כל תמונה z-מחסנית בין 10-30 s ואת זמן ההקלטה הכולל בין 10-30 דקות. לנתח את נדידת תאים CD8 T תושב כפי שמתואר הפניה4. לאחר ייבוא הנתונים כדי תוכנת מעקב, ליצור נקודות עבור כל תא CD8 T בשטח. להתאים את הקוטר של התאים את הסף של זיהוי על פי על תאים פלורסנט שבעורך. לבדוק את הרצועות ולהסיר כל רצועה לא רלוונטי על-ידי מחיקתן. רצועות הנכון על-ידי חיבור וניתוק מסלולים שונים של נקודות זמן שונות של המסילה אותו. לייצא את הנתונים (מהירות המסלול, אורך המסלול הזחה) תוכנת הגיליון האלקטרוני.