Ex-Vivo Bildgebung von Resident CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumor Scheiben mit konfokalen Mikroskopie

Menschliche Tumoren wurden mit Zustimmung der französischen Ethik-Ausschuß und von der Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) in Anwendung der Artikel L.1121-1 des französischen Gesetzes erhalten. Die Patienten vor Aufnahme in die Studie war eine schriftliche Einwilligung eingeholt. 1. Erhalt menschlichen Lungentumoren Erhalten Sie frische Lunge Tumorproben von Patienten mit Stadium-III nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die eine komplette chirurgische Resektion von ihrer Lunge Tumoren4unterzogen. Die nicht fixierten frische Tumor in 15 mL konische Röhrchen mit eiskalten Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) Medium zu transportieren. Legen Sie beiseite für 30 min auf Eis bis Schritt 2.7.Hinweis: Wenn Tumoren am Nachmittag empfangen werden, legen Sie sie bei 4 ° C über Nacht und am nächsten Tag verarbeiten. In diesem Fall ergänzen Sie das RPMI-1640 Medium mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS). (2) Agarose einbetten und Vibratome Schneiden von menschlichen Lungentumoren Hinweis: Führen Sie alle Schritte bis 2.10 unter sterilen Bedingungen. Bereiten Sie 5 % Agarose-Lösung für die Einbettung von 1 g niedrigschmelzende Punkt Agarose in 20 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium auflösen. Diese Lösung Mikrowelle, bis die Agarose komplett aufgelöst ist. Die Agarose bei 37 ° C abkühlen lassen, indem man die Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C für 5 min zu ermöglichen. Bereiten Sie in einer Gewebekultur-Haube komplette RPMI-1640 Medium (ohne Phenol-rot) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 4 mM L-Glutamin und 1 x Penicillin und Streptomycin. Ein 6-Well Zellplatte Kultur 1,1 mL komplette RPMI-1640 Medium pro Bohrloch hinzu, und legen Sie einen 30 mm Zelle Kultur Einsatz in jede Vertiefung. Beiseite der Plattenrandes in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min bis Schritt 2.12. Ort sterilisiert Edelstahl Unterlegscheiben (Innendurchmesser von 5 mm, außen ø 10 mm und 1 mm Dicke) in einer 35-mm-Plastikschale mit kompletten RPMI Medium gefüllt. Unterlegscheiben werden weiter verwendet werden, die Antikörper auf der Vibratome geschnittene Scheibe zu konzentrieren. Die Tumor-Biopsie in einer Plastikschale 10 cm und kleiner Würfel Form Fragmente von etwa 5 x 5 mm Länge geschnitten Sie den Tumor mit einer scharfen Klinge. Nehmen Sie die Agarose aus dem Inkubator und gießen Sie die Lösung in einer 35-mm-Plastikschale. Verwenden Sie ein paar Zangen übertragen sorgfältig die Tumor-Fragmente auf ein Gewebe zu wischen, die Überschreitung des Mediums zu entfernen. Einfügen Sie die Fragmente in der Agarose und positionieren Sie sie am unteren Rand der Plastikschale. Lassen Sie das Agarosegel auf Eis für 5 min zu festigen. Sobald die Agarose erstarrt, invertieren Sie die Plastikschale und mit einem Spatel, das gesamte Gel freizugeben. Verwenden Sie ein scharfes Messer, schneiden Sie die überschüssige Agarose rund um den Tumor Fragment, ca. 3-5 mm Gel um das Gewebe zu verlassen. Montieren Sie jeder Agarose-Block auf die Probe-Scheibe aus der Vibratome mit einem Tropfen ungiftig Butyl Cyanacrylat Gewebekleber. Füllen Sie das Vibratome Puffer Fach mit sterilen eiskaltem PBS und installieren Sie der Probe-Festplatte, in das Fach. Schnitt der Agarose eingebettet Gewebe in 350 µm dicke Scheiben schneiden. Passen Sie die Einstellungen der Vibratome mit einer langsamen Bereich Geschwindigkeit (0,2-0,3 mm/s) und die Schwingfrequenz im mittleren Bereich (1,5 mm). Sammeln Sie mit feinen Pinzette, sorgfältig die Tumoren Scheiben, wie sie gekürzt werden und Sie sie flach auf die Zelle Kultur Einsätze von einer 6-Well-Platte (Schritt 2.3 legen). 1 Scheibe bei jeder Einfügung zu übertragen. Verwenden Sie großen Sorgfalt beim Umgang mit Scheiben wie sie leicht beschädigt werden können. Verwenden Sie feine Pinzette, um Edelstahl Unterlegscheiben auf jede einzelne Scheibe zu platzieren. Sicherstellen Sie, dass die Scheiben auf die Agarose rund um das Tumorgewebe gut positioniert sind. Pflegen Sie die Kultur-Platte bei 37 ° C in einem 5 % CO2 befeuchteten Inkubator für 10 min. weiter Immunostaining. (3) Immunostaining resident CD8 T-Zellen und Tumorzellen Verdünnen Sie die Antikörper (Endkonzentration 10 µg/mL) und der nuklearen Farbstoff (Endkonzentration 1 µg/mL) in RPMI-1640 Medien ohne Phenol rot.Hinweis: Verwenden Sie Fluoreszent-gekoppelte Anti-CD8 (murine IgG Klonen SK1) und Anti-EpCAM (Epithelzelle Adhäsionsmolekül) (murine IgG HEA-125) Antikörper CD8 T-Lymphozyten und Tumor epithelialer Zellen bzw. beschriften. Fluoreszent-gekoppelte Anti-CD90/Thy1 (murine IgG, Klon 5E10) Antikörper zu Label Fibroblasten und aktivierten Endothelzellen zu verwenden. Verwenden Sie 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) um den Kern der Zellen mit einem kompromittierten Plasmamembran zu beschriften, um Gewebe Lebensfähigkeit zu bewerten. Entfernen Sie die Kultur-Platten aus dem Inkubator und mit einer Pipette aspirieren Sie keine Flüssigkeit in die Edelstahl-Unterlegscheiben. Entfernen Sie nicht die 1,1 mL RPMI-1640-Medien unter der Zelle Kultur Einsätze (Schritt 2.3) gestellt. Ohne die Scheibe zu berühren und mit einer Pipettenspitze, fügen Sie 40 µL der Lösung, die Antikörper auf jeder Tumor Scheibe enthält hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 15 min um Antikörper Färbung zu ermöglichen. Entfernen Sie mit feinen Pinzette die Unterlegscheiben, die Scheiben und Tauchen Sie 10 s in RPMI-1640 Medien ohne Phenol rot herausnehmen. Legen Sie die Scheiben auf die Zelle Kultur Einsätze zurück und geben Sie einen Tropfen von Phenol Rotfrei RPMI-1640 mittlere auf jede einzelne Scheibe. Pflegen Sie die Platte bei 37 ° C für 10 Minuten weiter zu Bildgebung. (4) imaging und Analyse von resident CD8 T Zelle Migration innerhalb der menschlichen Lunge Tumor Scheiben Hinweis: Die confocal Mikroskop verwendet in diesem Protokoll ist eine aufrechte, spinning-Disk mit einer 25 x Wasser eintauchen Ziel ausgestattet (25 x / 0,95 N.A). Mikroskop-Installation vorbereiten Stellen Sie die Temperatur des Mikroskop-Wärmekammer bei 37 ° C ein paar Stunden vor Beginn der bildgebenden anzupassen. Einrichtung eines Systems zur Tumor-Scheiben mit ständig durchspülen Sauerstoff (5 % CO2, 95 % O2) Phenol Rotfrei RPMI Medium (Abbildung 1). Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe die Perfusion Medien in der bildgebenden Kammer fließen und aspirieren Sie die Lösung in eine Müllabfuhr-Kolben. Führen Sie die peristaltische Pumpe, damit die oxydierten Lösung durch die Perfusion Röhren gehen kann. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette die Scheibe vom 6-Well-Platte und Transfer zu den 35-mm-Plastikschale mit Phenol Rotfrei RPMI Medium gefüllt. Die Scheibe mit einem 19,7 mm Durchmesser Scheibe Anker mit 2 mm Abstand-Threads zu immobilisieren. Platzieren Sie die Petrischale auf der bildgebenden Bühne des Mikroskops. Schließen Sie die Einlass und Auslass Spitzen der Perfusion System. Perfusion einschalten und den Durchfluss von Medien auf 0,8 mL/min eingestellt. Das Eintauchen in Wasser Ziel, die Scheibe zu senken. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Scheibe mit Hellfeld Licht.Verwenden geeignetes fluoreszierendes Licht, wählen Sie eine Region von Interesse, die CD8 T-Zellen, Tumor Inselchen (positiv für EpCAM) und einem Stroma-Bereich (positiv für CD90) enthält. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Scheibe durch die Bewertung DAPI Färbung an der Schnittfläche und tiefer in das Gewebe.Hinweis: Ein gesundes Stück enthält nur eine Minderheit der DAPI positive Zellen in mehreren Mikrometern aus der Schnittfläche. Legen Sie eine bildgebende Sitzung mit den folgenden Aktionen. Abhängig von der Intensität der das Fluoreszenzsignal 3 Fluorophore legen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 bis 800 ms und die Laserstärke zwischen 20 bis 40 %. Wählen Sie die Z-Stack-Stärke Bild innerhalb der Tumor-Slice.Hinweis: Hier wurden 10-12 optische Flugzeuge überspannt eine Gesamttiefe von 60-70 µm in der Z-Dimension erfasst. Wählen Sie die Startposition bei ca. 10 µm unterhalb der ersten beschrifteten CD8 T-Zellen. Definiert das Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapel Bilder zwischen 10 bis 30 s und die Gesamtaufnahmezeit zwischen 10 bis 30 Minuten. Analysieren Sie resident CD8 T Zellwanderung, wie in Referenz4beschrieben. Nach dem Import der Daten in eine Tracking-Software Erstellen Sie Spots für jede CD8 T-Zelle im Feld. Passen Sie der Durchmesser der Zellen und die Schwelle der Erkennung auf die abgebildeten fluoreszierenden Zellen entsprechend an. Überprüfen Sie die Tracks und entfernen Sie irrelevant Spuren zu, indem Sie sie löschen. Richtigen Tracks von anschließen und trennen verschiedene Tracks und verschiedenen Zeitpunkten der gleichen Tracks. Exportieren Sie die Daten (Track Geschwindigkeit, Streckenlänge Verschiebung) in ein Tabellenkalkulationsprogramm.