Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

Les tumeurs humaines ont été obtenus avec l’accord du Comité d’éthique Français et de l’Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP) en application de l’article L.1121-1 du code Français. Un consentement éclairé a été obtenu chez les patients avant l’inclusion dans l’étude. 1. obtenir des tumeurs du poumon chez l’humain Obtenir des échantillons de tumeur poumon frais auprès de patients présentant un cancer du poumon non à petites cellules stade I à III qui ont subi une résection chirurgicale complète de leurs tumeurs de poumon4. Transport la tumeur frais non fixée au tube conique 15 mL contenant le support glacé de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640). Mettre de côté sur la glace pendant 30 min avant l’étape 2.7.Remarque : Lorsque les tumeurs sont reçus dans l’après-midi, les placer à 4 ° C pendant la nuit et processus le lendemain. Dans ce cas, compléter les médias RPMI-1640 avec 5 % sérum fœtal (SVF). 2. Agarose incorporation et vibratome tranchage des tumeurs du poumon chez l’humain Remarque : Effectuez toutes les étapes jusqu’à 2,10 dans des conditions stériles. Préparer une solution 5 % d’agarose pour l’enrobage en dissolvant 1 g bas point de fusion point d’agarose dans 20 mL stérile de solution saline tamponnée au Phosphate (PBS) sans calcium et magnésium. Cette solution au micro-ondes jusqu’à dissolution complète de l’agarose. Permettre l’agarose refroidir à 37 ° C en plaçant la solution dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min. Sous une hotte de culture tissulaire, préparer le milieu RPMI 1640 complet (sans rouge de phénol) contenant 10 % sérum fœtal (SVF), glutamine mM 4 L et 1 x la pénicilline et la streptomycine. Ajouter le milieu RPMI 1640 complet de 1,1 mL par puits d’une plaque de culture de cellules de 6 puits et placer un insert de culture cellulaire 30 mm dans chaque puits. Mettre la plaque de côté dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min avant l’étape 2.12. Place stérilisés rondelles plates en acier inoxydable (diamètre intérieur de 5 mm, à l’extérieur de 10 mm de diamètre et l’épaisseur de 1 mm) dans un plat en plastique rempli de milieu complet RPMI en 35 mm. Rondelles servira encore à concentrer les anticorps sur la tranche de coupe-vibratome. Placer la biopsie de la tumeur dans un plat en plastique de 10 cm et couper la tumeur avec une lame tranchante en fragments de forme de petit cube d’environ 5 x 5 mm de longueur. Retirez l’agarose de l’incubateur et verser la solution dans un plat en plastique de 35 mm. Utilisez une paire de pinces pour transvaser avec soin les fragments de la tumeur à une lingette de tissu pour enlever l’excès de moyen. Insérez les fragments dans l’agarose et placez-les au fond du plat en plastique. Laisser le gel d’agarose sur glace pendant 5 min à se solidifier. Une fois que l’agarose se solidifie, renverser le plat en plastique et utilisez une spatule pour libérer le gel entier. Utilisez une lame tranchante pour couper l’excès d’agarose entourant le fragment de la tumeur, laissant 3 à 5 mm de gel autour du tissu. Montez chaque bloc d’agarose sur le disque de spécimen du vibratome avec une goutte de colle de tissus non toxique butyl cyanoacrylate. Remplir la cuve à tampon vibratome avec PBS glacee stérile et installer le disque de spécimen dans la barre d’État. Couper l’agarose incorporé tissu en tranches épaisses de 350 µm. Ajustez les paramètres vibratome à une vitesse lente gamme (0,2 à 0,3 mm/s) et la fréquence de vibration à une distance moyenne (1,5 mm). À l’aide de pinces fines, recueillir soigneusement les tranches de tumeurs car ils sont coupés et les placent à plat sur les inserts de culture cellulaire d’une plaque de 6 puits (étape 2.3). Transférer 1 tranche à chaque insertion. Utilisez le grand soin lors de la manipulation des tranches comme ils peuvent être facilement endommagées. Pince fine permet de poser les rondelles en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle. Assurez-vous que les rondelles soient bien positionnées sur l’agarose entourant le tissu tumoral. Maintenir la plaque de culture à 37 ° C dans une étuve humidifiée 5 % CO2 pendant environ 10 minutes procédez à immunostaining. 3. immunomarquage des cellules T CD8 résidents et les cellules tumorales Diluer les anticorps (concentration finale 10 µg/mL) et le colorant nucléaire (concentration finale 1 µg/mL) en milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol.Remarque : Utilisez fluorescent couplé anti-CD8 (IgG murine, clone SK1) et anti-EpCAM (molécule d’adhésion cellulaire épithéliale) (l’IgG murine HEA-125) anticorps d’étiqueter les lymphocytes T CD8 et tumeur des cellules épithéliales, respectivement. Utiliser des anticorps fluorescent couplé anti-CD90/Thy1 (IgG murine, clone 5E10) étiquette fibroblastes et les cellules endothéliales activées. Utilisez 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) d’étiqueter le noyau des cellules avec une membrane plasmique compromise afin d’évaluer la viabilité des tissus. Enlever les plaques de culture de l’incubateur et utiliser une pipette pour aspirer un liquide à l’intérieur des rondelles en acier inoxydable. N’enlevez pas le support de 1,1 mL RPMI 1640 placé sous les inserts de culture cellulaire (étape 2.3). Sans toucher la tranche et à l’aide d’un embout de la pipette, ajouter 40 µL de la solution contenant les anticorps sur chaque tranche de tumeur. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 15 min permettre des anticorps. Avec une pince fine, retirer les rondelles, retirer les tranches et trempette eux 10 s en milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol. Introduire à nouveau les tranches sur les inserts de culture cellulaire et ajouter une goutte de rouge de phénol-libre RPMI-1640 moyenne sur chaque tranche individuelle. Maintenir la plaque à 37 ° C pendant 10 min. passez à l’imagerie. 4. imagerie et analyse de migration des cellules T CD8 résidente dans les tranches de tumeur du poumon humain Remarque : La microscopie confocale utilisée dans le présent protocole est verticale tourne disque équipé d’un 25 x objectif à immersion d’eau (25 x / 0,95 N.A.). Préparer le programme d’installation de microscope Régler la température de la chaleur-chambre de microscope à 37 ° C quelques heures avant de commencer la séance d’imagerie. Mettre en place un système pour perfuse constamment les tranches de la tumeur avec oxygénée (5 % CO2, 95 % de O2) un milieu RPMI sans rouge de phénol (Figure 1). Utiliser une pompe péristaltique à couler les médias de perfusion dans la chambre d’imagerie et d’aspirer la solution dans une fiole de collecte des déchets. Faire fonctionner la pompe péristaltique pour permettre à la solution oxygénée de passer par les tubes de perfusion. Avec une pince fine, retirer la tranche de la plaque 6 puits et le transfert pour le plat en plastique de 35 mm rempli avec un milieu RPMI sans rouge de phénol. Immobiliser la tranche avec une ancre de tranche de diamètre 19,7 mm à 2 mm espacés-filetage. Placez la boîte de Pétri sur la scène d’imagerie du microscope. Connectez l’extrémité d’entrée et de sortie du système de perfusion. Allumez le système de perfusion et régler le débit de médias à 0,8 mL/min. Abaisser l’objectif immersion dans l’eau à la tranche. Mettre l’accent sur le dessus de la tranche avec la lumière du champ lumineux.Éclairage fluorescent approprié, sélectionnez une région d’intérêt qui contient des cellules T CD8, d’îlots de tumeur (positifs pour EpCAM) et une zone de stroma (positive pour CD90). Vérifier la viabilité des cellules au sein de la tranche en évaluant le DAPI, coloration à la surface coupée et plus profondément dans le tissu.Remarque : Une tranche saine contient seulement une minorité de cellules positives DAPI à quelques microns de la surface de coupe. Définir une session d’imagerie avec les actions suivantes. Selon l’intensité du signal fluorescent des 3 fluorophores, définir le temps d’exposition entre 50 et 800 ms et l’intensité du laser entre 20 à 40 %. Sélectionnez l’épaisseur z de pile pour l’image dans la tranche de la tumeur.NOTE : Ici, 10-12 avions optiques s’étendant sur une profondeur totale de 60-70 µm dans la dimension z ont été capturées. Sélectionnez la position de départ à environ 10 µm ci-dessous les premières cellules T CD8 marqués. Définissez l’intervalle de temps entre chaque image z-pile entre 10 et 30 s et la durée d’enregistrement totale comprise entre 10 et 30 min. Analyser la migration des cellules T CD8 résidente tel que décrit dans référence4. Après avoir importé les données à un logiciel de suivi, créer des spots pour chaque cellule CD8 T dans le domaine. Ajuster le diamètre des cellules et le seuil de détection selon sur les cellules fluorescentes imagés. Inspecter les pistes et supprimer n’importe quelle piste hors de propos en les supprimant. Pistes correctes de branchement et débranchement des différentes pistes et des moments différents des mêmes voies. Exporter les données (piste vitesse, longueur de déplacement des voies) dans un logiciel de feuille de calcul.