السابقين فيفو تصوير لمفاوية T CD8 المقيم في ورم الرئة البشرية شرائح باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]
Summary
ويصف هذا البروتوكول أسلوب للصورة المقيم التسلل إلى الورم CD8 تي الخلايا المسماة بالأجسام المضادة فلوريسسينتلي يزوج داخل شرائح ورم الرئة البشرية. هذا الأسلوب يسمح تحليل في الوقت الحقيقي للهجرة الخلية CD8 تي استخدام الفحص المجهري [كنفوكل].
Abstract
خلية CD8 T هي الجهات الفاعلة الرئيسية في مجال مكافحة السرطان. أنهم بحاجة إلى الدخول في الورم كي الخلايا التائية CD8 لقتل الخلايا السرطانية، تهاجر داخل ورم المكروية والاستجابة على نحو كاف لمولدات الورم. التطورات الأخيرة لتحسين النهج التصوير، مثل الفحص المجهري 2-فوتون، واستخدام نماذج الورم الماوس قوية تلقي ضوءا على بعض الآليات التي تنظم أنشطة الخلية تي المضادة للورم. بينما نظم من هذا القبيل قد قدمت أفكاراً قيمة، أنهم لا دائماً التنبؤ بالاستجابات البشرية. في الإنسان، معارفنا في هذا المجال يأتي أساسا من وصف لعينات الورم ثابت من البشر المرضى، فضلا عن الدراسات في المختبر . ومع ذلك، نماذج في المختبر تفتقر إلى الوسط ورم ثلاثية الأبعاد المعقدة وبالتالي، هي تقريبية غير مكتملة في فيفو أنشطة الخلية T. شرائح جديدة مصنوعة من أنسجة اكسبلانتيد تمثل بيئة معقدة ورم متعددة الخلايا التي يمكن أن تعمل كحلقة وصل هامة بين دراسات شارك مثقف ونماذج حيوانية. الآن قد أنشئت أصلاً في العقد الليمفاوية مورين1 والموصوفة سابقا في جوف المادة2، تم نقلها هذا النهج إلى الأورام البشرية لدراسة ديناميات مطلي3 فضلا عن الخلايا T المقيمين4.
ويرد هنا، على بروتوكول لإعداد شرائح ورم الرئة البشرية، إيمونوستينينج من المقيمين تي CD8 وورم الخلايا، وتتبع الخلايا اللمفية تي CD8 داخل ورم المكروية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. وهذا النظام فريد الموضوعة على الشاشة لوكلاء المناعي رواية تحابي الهجرة الخلية تي في الأورام.
Introduction
الخلايا التائية CD8 دوراً رئيسيا في المعركة ضد السرطان. ومع ذلك، منع العديد من الآليات القمعية لمفاوية T من قتل الخلايا الخبيثة. خلال السنوات الماضية، تم وضع العديد من الاستراتيجيات الواعدة التي حرر الفرامل في خلايا تي والمستخدمة في العيادة5. النهجين التي تحتفظ بقدر كبير من الاهتمام استهداف نقطة تفتيش محصنة ضد الأجسام المضادة، مثل العلاجات خلية T المضادة-PD-1 والتبني. ومع ذلك، وعلى الرغم من النجاحات التي تحققت مؤخرا، مجموعة فرعية فقط من المرضى الاستفادة من هذه العلاجات6. تحديا رئيسيا لتحديد آليات لمقاومة السرطان العلاج المناعي من أجل تطوير علاجات أكثر فعالية. تحد آخر هو تطوير نظم نموذجية في الرواية التي يمكن أن تتميز العلاجات واختبارها على فاعلية وسلامة. وحتى الآن، تستند معظم هذه الاختبارات في المختبر خلية ثقافة النظم التي تحاكي الطابع المعقد للأنسجة السرطانية سيئة.
السابقين فيفو شرائح الأنسجة تقنية واعدة، كما أنه يحافظ على النسيج الأصلي المكروية7. على مر السنوات، أنشأنا هذا النهج لتتبع ديناميات الخلايا اللمفية تي في الأنسجة المختلفة. نتائجنا تشير إلى أن المسمى فلوريسسينتلي خلايا تي أضيف فوق شرائح العقدة الليمفاوية مورين تهاجر إلى الأنسجة، والاستجابة لتلك المناسبة العظة ميكرونفيرونمينتال1،2. وبالمثل، يجند لمفاوية T مضافين إلى شرائح ورم الرئة البشرية سريعاً في ستروما ورم3. باستخدام هذا الأسلوب، حددنا المصفوفة خارج الخلية كعنصر هام في السيطرة على توزيع والهجرة للخلايا T داخل الأورام البشرية3،4. نظراً للسلوك السابقين فيفو تنقيته ومطلي خلايا تي لا تعكس بالضرورة سلوك المقيمين intratumoral تي الخلايا الليمفاوية، ونحن قد مؤخرا صقل هذا النهج4.
هنا يصف لنا وضع بروتوكول لتعقب الخلايا اللمفية تي المقيمين داخل شرائح من أورام الرئة البشرية الطازجة. الخطوات المختلفة التي تتألف من إعداد الشرائح ورم الرئة البشرية (بما في ذلك [اغروس] التضمين وتمزيقها فيبرتوم الأنسجة المضمنة)، تلطيخ الخلايا الذاتية مع الأجسام المضادة الفلورسنت في الشرائح الطازجة الورم، ورصد هذه الخلايا مع مجهر [كنفوكل].
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد وصف تقنية بسيطة وسريعة وقوية لتوليد شرائح ورم الرئة البشرية وتقييم السلوك الديناميكي للخلايا التائية CD8 المقيم في بيئة ورم يتم الحفاظ عليها باستخدام مجهر [كنفوكل]. هذا البروتوكول هو صقل المادة جوف السابقة التي تصف رصد خلايا تي مطلي على العقدة الليمفاوية مورين شرائح2.
يجب اعتبار تبييض الأصباغ الفلورية خصوصا مع الأصباغ الجيل الأول مثل fluorescein isothiocyanate وفيكوريثرين. ووجدنا أن فوتوبليتشينج وضوحاً للأجسام المضادة إلى جانب مباشرة حدث مع مجهر اثنين-فوتون. وفي المقابل، لوحظ فوتوبليتشينج الحد الأدنى مع مجاهر [كنفوكل]، خاصة باستخدام الأصباغ الفلورية المشرقة وضعت مؤخرا.
الأجسام المضادة جزيئات كبيرة نسبيا وذلك اختراق الأنسجة يمكن أن يكون صعباً. ويمكن تحسين هذه الخطوة بزيادة فترة الحضانة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام أصغر تلطيخ شظايا الكواشف مثل مباشرة إلى جانب القوات المسلحة البوروندية من الأجسام المضادة يمثل بديلاً جيدا.
تم التحقق من صحة جميع الأجسام المضادة المبينة في هذا البروتوكول ومعروفة لإنتاج المصبوغة مشرق4سابقا. ولذلك، ايستب عناصر التحكم غير مطلوبة. ومع ذلك، إذا كان المرغوب فيها تعديلات لهذا الأسلوب باستخدام أجسام مضادة أخرى، ثم استخدام ايستب مراقبة الأجسام المضادة ينصح بشدة.
ويعرض هذا النظام التجريبي بعض القيود. الإجراء القطع سيضر الأنسجة، والتي قد تؤثر على سلوك الخلايا التائية CD8، خصوصا بالقرب من سطح قطع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فقدان عدد من العوامل القابلة للذوبان (مثل المستقطبات) دور فعال في السيطرة على هجرة الخلايا T. أحد السبل لتجاوز هذه المشاكل عن طريق رصد خلايا T الموجودة في عدة عشرات من ميكرون من على سطح الأرض في مناطق يفترض أنها أكثر صحة من الأنسجة. وتكشف التجارب المنشورة أن ترحيل الخلايا تي مترجمة عميقة داخل الأنسجة بنشاط أكبر من خلايا تي مترجمة قرب سطح قطع4. أننا استخدمنا مجاهر [كنفوكل] لدراساتنا، لكن من المرجح أن المجاهر اثنين-فوتون ستزيد القرار المكانية في العمق.
هذا النهج يعتمد على استخدام الأجسام المضادة إلى جانب فلوريسسينتلي التي لا تكون جزيئات محايدة. الأجسام المضادة لكامل الحجم عرضه لتؤثر على السير العادي للخلايا T بطرق مختلفة. أولاً، يمكن أن تغير الأجسام المضادة-CD8 الهجرة الخلية T بالتسبب تتالي إشارات داخل الخلايا قادرة على التأثير على سيتوسكيليتون اللمفاويات. وثانيا، يمكن أن تعدل الأجسام المضادة-CD8 التفاعل بين CD8 و MHC الفئة الأولى الجزيئات، خطوة هامة في عملية التعرف على المستضد. يمكن ربط مستقبلات Fc التي أعرب عنها العديد من الخلايا النقوي الموزعة في الورم وعرضه لذلك أجسام سليمة، والثالثة زيادة الإشارات غير محددة. لدينا أي دليل على أن هذه مشكلة تؤثر البيانات المتوفرة لدينا، ربما لأن مستقبلات Fc الخلايا النقوي المقيم، خلافا للخلايا في الثقافة، مشبعة المناعية داخل الوسط الورم. وفي الواقع، لم تتغير إضافة المصل أثناء عملية وضع العلامات، عملية تعرف بكتلة حرة Fc المستقبلات، المناعية تلطيخ. على الرغم من ذلك، القوات المسلحة البوروندية أجزاء من الأجسام المضادة، تخلو من منطقة Fc، فضلا عن الأجسام المضادة المتحولة في منطقتها Fc و أجزاء جسم المستمدة من الكامليد8 تمثل استراتيجيات أخرى بديلة لتعقب الخلايا المقيمين مع تتبع الفلورسنت.
على مدى العقود الماضية، وتم وضع عدة نظم نموذجية وتستخدم للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا اللمفية تي. وتشمل هذه الاستعدادات في المختبر تي الخلايا سابقا المنقي ومثقف مع عرض مستضد الخلايا. وسمحت هذه الأعمال التحضيرية تقدما ملحوظا في تحديد آليات الاعتراف مستضد، والقدرة على الاستجابة. بيد أنها تفتقر إلى الطابع المعقد للبيئة الأنسجة. وتم إنشاء الأعمال التحضيرية الأخرى أكثر عن كثب تقليد هيكل الأنسجة الأصلية. للحصول على أمثلة، مصفوفات جل الكولاجين ثلاثي الأبعاد في الخلايا تي النقية التي قد تم تضمينها، فضلا عن ثقافة ريجريجاتيد الأنسجة الشظايا قد استخدمت لرصد السلوك الديناميكي للخلايا اللمفية تي مع الفلورسنت التصوير التكنولوجيات9 . تقدم هذه الأنظمة في الاستفادة من بنية قريبة من الأنسجة الأصلية، لكنها تفتقر إلى عوامل هامة أخرى الخلوية وقابل للذوبان. في الماوس، استخدمت اثنين-فوتون إينترافيتال الفحص المجهري لتعقب الخلايا T في بيئة حقاً الفسيولوجية الجهاز سليمة10. بيد أن مثل هذا النهج صعبة تقنيا لإعداد. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج الماوس تظهر اختلافات ملحوظة مع علم وظائف الأعضاء البشرية.
ويمثل الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول في بيئة معقدة متعددة الخلايا ورم فريد يسمح لها العمل كحلقة وصل هامة بين دراسات الثقافة المشتركة ونماذج حيوانية.
يمكن أيضا استخدام البروتوكول الموضحة هنا لتتبع الحركية الخلايا الأخرى من الخلايا اللمفية تي CD8 التي تم إنشاؤها بالأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها للبشرية ومورين الأورام والأنسجة الأخرى. على سبيل المثال، تمكنا من أن الصورة في الوقت الحقيقي المسمى ديناميات الخلايا ب مع جسم المضادة-CD19 في اللوزتين البشرية الطازجة.
الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح للشاشة لجزيئات علاجية مراقبة حركية الخلية تي في الأنسجة. إمكانية الوصول إلى نظام الثقافة يسمح لتطبيق بعض الكواشف الدوائي واختبار آثارها على الهجرة الخلية T. من المقبول الآن أن الخلايا التائية CD8 في نمو الأورام، يحمل هجرة منخفضة وخفضت صلات مع خلايا الورم11. الأهم من ذلك، وجود خلايا تي في ورم خلايا المناطق الشحيحة يرتبط بالتوصل إلى نتائج سيئة ويعتبر إحدى آليات المقاومة للسرطان يستند إلى الخلية تي العلاج المناعي. وقد حددت عدة عقبات تحد من خلايا تي من الهجرة في الأورام بما في ذلك مصفوفة خارج الخلية كثيفة. وفي هذا الصدد، تحديد جزيئات قادرة على استعادة خلية T حركية والتفاعل مع الخلايا الخبيثة يمثل خطوة هامة في العلاج المناعي السرطان. وفي دراسة سابقة، وجدنا أن يحسن إلى تحلل جزئي للكولاجين كولاجيناز، شدة تطبيقها على الشرائح الرئة البشرية، مع جهة الاتصال للخلايا T مع الخلايا السرطانية.
أخيرا، يوفر إمكانية للحفاظ على شرائح الورم البشري في الثقافة لما يصل إلى عدة أيام7،،من1213 عددا من التطبيقات الواعدة في المدة من خلايا تي والعلاج المناعي.بيد أن استقرار النظام النموذجي خلال الثقافة طويل الأجل هو معلمة هامة التي تحتاج إلى تقييم دقيق.
الحصول على أنسجة جديدة وسليمة عامل حاسم لإنتاج شرائح نوعية مع إيمونوستينينج جيدة CD8 الخلايا والخلايا السرطانية، وعناصر اللحمية. حفظ خزعة الورم عند 4 درجة مئوية قبل معالجة أمر حاسم.
التعامل مع الشرائح مع غرامة الملقط يمثل خطوة حاسمة أخرى ضمن هذا البروتوكول. وهذا ينبغي أن يجري بعناية كبيرة كما [اغروس] يمكن أن تتلف بسهولة. سوف ينال قطع في [اغروس] ختم المقدمة من الفولاذ المقاوم للصدأ الغسالة أسفر عن تسرب للأجسام المضادة التي تحتوي على حلول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر بيير بوردونكلي، وتوماس جيلبرت كوشين التصوير مرفق (معهد كوشين، باريس) لتقديم المشورة والمساعدة مع مجاهر. كان يؤيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من “الرابطة الفرنسية” الوطنية جنيه مكافحة السرطان، كاربيم (أبحاث السرطان للطب الشخصي)، في مؤسسة فرنسا وافق 2020 برنامج الاتحاد الأوروبي في البحوث والابتكار في إطار المنحة اتفاق لا 667980 (قيراط).
Materials
| Upright confocal microscope | Leica | The use of a spinning disk confocal is recommended | |
| Imaris software | Bitplane | This sofware is used for visualization of images and tracking of T cell migration | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, GlutaMAX Supplement | ThermoFisher | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 20012019 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Non-toxic butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Slice anchors, 19.7 diameter, 2 mm spacing threads | Warner Instruments | 64-1415 | |
| Stainless steel washers, 5 mm of inner diameter | Amazon | B004K1FDGQ | |
| BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 565289 | |
| FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125) | Miltenyi Biotec | 130-098-113 | |
| BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10) | Biolegend | 328125 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 |
References
- Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner. J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).
- Salmon, H., et al. Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes. J Vis Exp. (53), e3054 (2011).
- Salmon, H., et al. Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors. J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).
- Bougherara, H., et al. Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration. Front Immunol. 6, 500 (2015).
- Mandal, R., Chan, T. A. Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy. Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).
- Wolchok, J. D., et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).
- Rashidian, M., et al. Noninvasive imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
- Joyce, J. A., Fearon, D. T. T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment. Science. 348 (6230), 74-80 (2015).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).
