Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

La fosforilación de proteínas en un residuo específico juega un papel importante en una amplia gama de procesos celulares. Por lo tanto, la comprensión de las redes de señalización requiere la identificación de sitios específicos de fosforilación. Además, el sitio de fosforilación determina el efecto sobre la función de la proteína porque los dominios individuales dentro de una proteína poseen estructuras y funciones diferentes. La actividad del Factor 2 del factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), un factor clave de transcripción antioxidante, es regulada bidireccionalmente a través de la fosforilación en diferentes sitios. Nuestros estudios se han centrado en las quinasas que catalizan la fosforilación de Nrf2. La respuesta al estrés de Nrf2 frente a la exposición oxidativa se produce rápidamente, principalmente a través de la fosforilación en la serina 40 y mediada por la proteína quinasa C (PKC) -δ, que activa Nrf2 ^{3 , 4} . Por el contrario, Fyn cataliza la fosforilación inhibitoria de Nrf2 en la tirosina 568 para el control estricto de la actividad ⁵ .

El método más común utilizado para descubrir sitios de fosforilación es el análisis de cromatografía líquida / espectrometría de masas (LC / MS). Los datos de mapeo de sitios de fosforilación rápidos y altamente sensibles pueden generarse de esta manera; Sin embargo, tiene varias limitaciones técnicas, a menudo generando señales falsas-negativas. La mala cobertura de la secuencia ocurre con frecuencia en el análisis LC / MS. Para identificar los sitios de fosforilación, la información sobre la máxima cobertura de aminoácidos de una proteína es necesaria [ ^6] . La proteólisis de la proteína de interés con varias proteasas durante la etapa de digestión puede ser de ayuda para mejorar la cobertura de la secuencia. Otro obstáculo para la identificación de los residuos de fosforilación es la fácil pérdida de ácido fosfórico que se observa con frecuencia para los péptidos fosforilados con serina y treonina 6,7. Los restos de fosfato lábiles son a menudoLiberado de fosfopéptidos durante el proceso de fragmentación ⁷ . La segunda opción cuando se buscan sitios de fosforilación está usando un método de microarrays de péptidos. Es posible detectar los sitios diana de cinasa usando un chip de microarrays que contiene fragmentos peptídicos derivados de una proteína de interés. Sin embargo, debido al requisito de equipo para la producción y detección de un chip de microarrays, el método de microarrays de péptidos se considera largo y costoso.

Para superar estos desafíos, se puede usar un ensayo de quinasa competitiva de oligopéptido in vitro para una proteína quinasa con motivos de reconocimiento conocidos. Si se establece el motivo de reconocimiento de consenso de una quinasa, se pueden predecir sitios de fosforilación putativos de un sustrato candidato, y se puede validar la autenticidad de los sitios. El método más convincente para este procedimiento es mostrar la abrogación de la fosforilación en una proteína mutante en la que la predictaD sustituido con un aminoácido no fosforilable ( es decir, serina o treonina a alanina, tirosina a fenilalanina). Sin embargo, la producción y aislamiento de proteínas mutantes lleva mucho tiempo. Como alternativa en la fase inicial de la investigación, el ensayo competitivo de la cinasa peptídica es sencillo y conveniente. Aquí, describimos un protocolo para un ensayo de competición de péptidos in vitro y para la validación del sitio de fosforilación.