リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

特定の残基でのタンパク質リン酸化は、広範囲の細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。従って、シグナル伝達ネットワークの理解は、特異的なリン酸化部位の同定を必要とする。さらに、リン酸化部位は、タンパク質内の個々のドメインが異なる構造および機能を有するため、タンパク質機能に対する効果を決定する。主要な抗酸化転写因子である核因子エリトロイド2関連因子2（Nrf2）の活性は、異なる部位でのリン酸化によって双方向的に調節される。我々の研究は、Nrf2のリン酸化を触媒するキナーゼに焦点を当てている。酸化チャレンジに対するNrf2のストレス応答は、主にセリン40でのリン酸化を介して急速に起こり、Nrf2を活性化するプロテインキナーゼC（PKC）-δによって媒介される^3,4 。逆に、Fynは、チロシン5でNrf2の阻害的リン酸化を触媒するアクティビティの厳密な制御のために68。

リン酸化部位を発見するために使用される最も一般的な方法は、液体クロマトグラフィー/質量分析（LC / MS）分析である。迅速かつ高感度なリン酸化部位マッピングデータをこのように生成することができる。しかし、それにはいくつかの技術的な制限があり、しばしば偽陰性シグナルが生成されます。シーケンスのカバレッジが悪いと、LC / MS分析で頻繁に発生します。リン酸化部位を同定するためには、タンパク質の最大アミノ酸含量に関する情報が必要である⁶ 。消化工程中のいくつかのプロテアーゼによる目的タンパク質のタンパク質分解は、配列カバレッジを改善するのに役立つ可能性がある。リン酸化残基の同定のためのもう一つの障害は、セリンおよびトレオニンリン酸化ペプチドでしばしば観察されるリン酸の容易な損失である6,7。不安定なリン酸部分はしばしば断片化プロセス中にホスホペプチドから放出される。リン酸化部位を探索する場合の第2の選択肢は、ペプチドマイクロアレイ法を用いることである。目的のタンパク質に由来するペプチド断片を含むマイクロアレイチップを用いて、キナーゼ標的部位をスクリーニングすることが可能である。しかしながら、マイクロアレイチップの製造および検出のための装置要件のために、ペプチドマイクロアレイ法は時間がかかりかつ高価であると考えられている。

これらの課題を克服するために、インビトロオリゴペプチド競合キナーゼアッセイを、既知の認識モチーフを有するプロテインキナーゼのために使用することができる。キナーゼのコンセンサス認識モチーフが確立されれば、候補基質の推定上のリン酸化部位を予測することができ、部位の真正性を確認することができる。この手順の最も説得力のある方法は、突然変異体タンパク質におけるリン酸化の抑止を示すことであり、このタンパク質では、d残基は、非リン酸化性アミノ酸（ すなわち、セリンまたはトレオニンからアラニン;チロシンからフェニルアラニン）で置換される。しかしながら、突然変異体タンパク質の産生および単離は時間がかかる。研究の初期段階における選択肢として、競合的ペプチドキナーゼアッセイは簡単で便利である。ここでは、 インビトロペプチド競合アッセイおよびリン酸化部位の確認のためのプロトコールについて記載する。