Test de compétition Oligopeptide pour la détermination du site de phosphorylation

La phosphorylation des protéines à un résidu spécifique joue un rôle important dans un large éventail de processus cellulaires. Ainsi, une compréhension des réseaux de signalisation nécessite l'identification de sites spécifiques de phosphorylation. En outre, le site de phosphorylation détermine l'effet sur la fonction des protéines car les domaines individuels dans une protéine possèdent différentes structures et fonctions. L'activité du facteur 2 du facteur nucléaire 2 (Nrf2), un facteur de transcription antioxydant clé, est régulée bidirectionnellement par la phosphorylation sur différents sites. Nos études ont porté sur les kinases qui catalysent la phosphorylation de Nrf2. La réponse au stress de Nrf2 contre le défi oxydatif se produit rapidement, principalement par la phosphorylation à la serine 40 et médiée par la protéine kinase C (PKC) -δ, qui active Nrf2 ^{3 , 4} . Inversement, Fyn catalyse la phosphorylation inhibitrice de Nrf2 à la tyrosine 568 pour un contrôle strict de l'activité ⁵ .

La méthode la plus commune utilisée pour découvrir les sites de phosphorylation est l'analyse par chromatographie liquide / spectrométrie de masse (LC / MS). Des données de cartographie de sites de phosphorylation rapides et très sensibles peuvent être générées de cette façon; Cependant, il présente plusieurs limitations techniques, générant souvent des signaux faussement négatifs. Une mauvaise couverture séquentielle se manifeste fréquemment dans l'analyse LC / MS. Pour identifier les sites de phosphorylation, il est nécessaire d'obtenir des informations sur la couverture maximale d'acides aminés d'une protéine ⁶ . La protéolyse de la protéine d'intérêt avec plusieurs protéases pendant la phase de digestion peut être utile pour améliorer la couverture des séquences. Un autre obstacle à l'identification des résidus de phosphorylation est la perte facile d'acide phosphorique fréquemment observée pour les peptides phosphorylés par la serine et la thréonine ^{6 , 7} . Les fragments de phosphate labile sont souventLibéré à partir de phosphopeptides pendant le processus de fragmentation ⁷ . La deuxième option lors de la recherche de sites de phosphorylation est l'utilisation d'une méthode de microarray peptidique. Il est possible d'examiner les sites cibles de la kinase en utilisant une puce de microarray contenant des fragments peptidiques dérivés d'une protéine d'intérêt. Cependant, en raison de l'exigence d'équipement pour la production et la détection d'une puce de microarray, la méthode de microarray peptidique est considérée comme longue et coûteuse.

Pour surmonter ces défis, on peut utiliser un test de kinase concurrent d'oligopeptide in vitro pour une protéine kinase avec des motifs de reconnaissance connus. Si le motif de reconnaissance de consensus d'une kinase est établi, on peut prédire les sites de phosphorylation putatifs d'un substrat candidat et l'authenticité des sites peut être validée. La méthode la plus convaincante pour cette procédure est de montrer l'abrogation de la phosphorylation dans une protéine mutante dans laquelle le prédicteurD résidu est substitué par un acide aminé non phosphorylable ( c'est-à-dire la sérine ou la thréonine à l'alanine, la tyrosine à la phénylalanine). Cependant, la production et l'isolement des protéines mutantes prend du temps. Comme alternative au stade initial de la recherche, le dosage compétitif de la peptide kinase est simple et pratique. Ici, nous décrivons un protocole pour un test de compétition peptidique in vitro et pour la validation du site de phosphorylation.