Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling
Summary
Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.
Abstract
Proteïnefosforylering op specifieke locaties bepaalt zijn conformatie en interactie met andere moleculen. Zo beïnvloedt eiwitfosforylering biologische functies en eigenschappen van de cel. Momenteel is de meest voorkomende methode voor het ontdekken van fosforyleringsplaatsen door middel van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS) analyse, een snelle en gevoelige methode. Echter, relatief labiele fosfaatdelen worden vaak vrijgemaakt van fosfopeptiden tijdens de fragmenteringsstap, die vaak valse negatieve signalen oplevert. In dergelijke gevallen zou een traditionele in-vitro- kinase-analyse die gebruik maakt van plaatsgerichte mutanten nauwkeuriger zijn, maar deze methode is moeizaam en tijdrovend. Daarom kan een alternatieve werkwijze die peptidekompetitie gebruikt, voordelig zijn. Het consensus herkenningsmotief van 5 'adenosine monofosfaat-geactiveerde proteïne kinase (AMPK) is vastgesteld 1 en werd gevalideerd met behulp van een positionele scan peptide bibliotheek assAy 2 . Zo kunnen AMPK-fosforyleringsplaatsen voor een nieuw substraat voorspeld en bevestigd worden door de peptide competitiebepalingen. In dit rapport beschrijven we de gedetailleerde stappen en procedures voor de in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse door AMPK-gemedieerde nucleaire factor erythroid 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) fosforylering te illustreren. Om de fosforyleringsplaats te authenticeren, voeren we een sequentiële in vitro kinase-analyse uit met behulp van een plaatsspecifieke mutant. In het algemeen verschaft de peptidecompetitiebepaling een methode om meerdere potentiële fosforyleringsplaatsen te screenen en sites te identificeren voor validatie door de fosforyleringsplaatsmutanten.
Introduction
Proteïnefosforylering bij een specifiek residu speelt een belangrijke rol in een breed scala aan cellulaire processen. Zo vereist een begrip van signaleringsnetwerken de identificatie van specifieke fosforyleringsplaatsen. Daarnaast bepaalt de fosforyleringsplaats het effect op de eiwitfunctie omdat individuele domeinen binnen een eiwit verschillende structuren en functies bezitten. De activiteit van erythroid 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2), een belangrijke antioxidant transcriptiefactor, wordt tweerichtig geregeld door fosforylering op verschillende plaatsen. Onze studies hebben gericht op de kinases die de fosforylering van Nrf2 katalyseren. De stressrespons van Nrf2 tegen oxidatieve uitdaging komt snel voor, hoofdzakelijk door fosforylering bij serine 40 en gemedieerd door proteïne kinase C (PKC) -δ, die Nrf2 3 , 4 activeert. Omgekeerd katalyseert Fyn de remmende fosforylering van Nrf2 bij tyrosine 568 voor een strakke controle van de activiteit 5 .
De meest voorkomende methode die wordt gebruikt om fosforyleringsplaatsen te ontdekken is vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS) analyse. Snelle en zeer gevoelige fosforylatie site mapping data kan op deze manier worden gegenereerd; Het heeft echter verschillende technische beperkingen, die vaak valse negatieve signalen genereren. Slechte volgorde dekking voorkomt vaak in LC / MS analyse. Om fosforyleringsplaatsen te identificeren is informatie nodig over de maximale aminozuurdekking van een eiwit 6 . Proteolyse van het eiwit van belang met verschillende proteasen tijdens de spijsverteringstap kan helpen bij het verbeteren van sequentiedekking. Een ander obstakel voor de identificatie van fosforyleringsresten is het geluidsverlies van fosforzuur dat frequent waargenomen wordt voor serine- en threonine-gefosforyleerde peptiden 6 , 7 . Labile fosfaatdelen zijn vaakVrijgegeven van fosfopeptiden tijdens het fragmentatieproces 7 . De tweede optie bij het zoeken naar fosforyleringsplaatsen maakt gebruik van een peptide microarray methode. Het is mogelijk om te screenen voor de kinase target sites met behulp van een microarray chip bevattende peptide fragmenten afgeleid van een eiwit van belang. Door de apparatuurbehoefte voor de productie en detectie van een microarraychip, wordt de peptide microarray methode echter beschouwd als tijdrovend en duur.
Om deze uitdagingen te overwinnen kan een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse gebruikt worden voor een proteïnekinase met bekende herkenningsmotieven. Als het consensus herkenningsmotief van een kinase wordt vastgesteld, kunnen verwachte fosforyleringsplaatsen van een kandidaat substraat voorspeld worden en kan de authenticiteit van de sites worden gevalideerd. De meest overtuigende methode voor deze procedure is het onthouden van fosforylering in een mutant eiwit waarin de predicteD residu is gesubstitueerd met een niet-fosforyleerbaar aminozuur ( dwz serine of threonine tot alanine, tyrosine tot fenylalanine). De productie en isolatie van mutante eiwitten is echter tijdrovend. Als alternatief bij de eerste fase van onderzoek is de competitieve peptide kinase-analyse eenvoudig en handig. Hier beschrijven we een protocol voor een in vitro peptide competitie assay en voor de validatie van de fosforyleringsplaats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Als een eenvoudige en handige manier om de authenticiteit van de voorspelde fosforylatieplaatsen gemedieerd door AMPK te beoordelen, beschrijven we hier een in vitro kinase-analyse die kan worden gebruikt om een specifieke fosforyleringsplaats te ontdekken met behulp van competitieve peptiden en te verifiëren met behulp van een site-specifieke mutant . De representatieve data verkregen uit de in vitro competitieve AMPK activiteit assay matchde de resultaten van een assay met behulp van een plaat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Onderzoeksstichting van Korea subsidie gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 en nr. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
