أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة
Summary
وتستخدم المقايسات المنافسة الببتيد على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب الجزيئية والمناعية. هذه الورقة تصف طريقة مفصلة لفي المختبر أوليغوببتيد-تنافس فحص كيناز وإجراءات المصادقة المرتبطة بها، والتي قد تكون مفيدة للعثور على مواقع الفسفرة محددة.
Abstract
فسفرة البروتين في مواقع محددة يحدد التشكل والتفاعل مع جزيئات أخرى. وهكذا، يؤثر الفسفرة البروتينية على الوظائف البيولوجية وخصائص الخلية. حاليا، الأسلوب الأكثر شيوعا لاكتشاف مواقع الفسفرة هو التحليل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي (لك / مس)، طريقة سريعة وحساسة. ومع ذلك، غالبا ما يتم الإفراج عن شظايا الفوسفات خفيف نسبيا من فوسفوببتيدس خلال خطوة تجزئة، والتي غالبا ما تعطي إشارات سلبية كاذبة. في مثل هذه الحالات، فإن مقايسة كيناز التقليدية في المختبر باستخدام المسوخ الموجهة للموقع تكون أكثر دقة، ولكن هذه الطريقة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن طريقة بديلة باستخدام المنافسة الببتيد قد تكون مفيدة. تم إنشاء عزر الاعتراف بالإجماع من 5 'كينوس الأدينوزين أحادي الفوسفات كيناز (أمك) 1 وتم التحقق من صحة باستخدام الموضعية مسح الببتيد مكتبة الحمارأي 2 . وهكذا، يمكن توقع مواقع الفسفرة أمك لركيزة الرواية وأكدت من قبل المقايسات المنافسة الببتيد. في هذا التقرير، ونحن تصف الخطوات والإجراءات التفصيلية للالمختبر في أوليغوبيبتيد تنافس مقايسة كيناز من خلال توضيح أمك عامل بوساطة النووية إريثرويد 2 ذات الصلة عامل 2 (Nrf2) الفسفرة. لمصادقة موقع الفسفرة، قمنا بتنفيذ متتابعة في المختبر فحص كيناز باستخدام متحولة موقع محدد. وعموما، يوفر فحص المنافسة الببتيد طريقة لفحص مواقع الفسفرة المحتملة متعددة وتحديد المواقع للتحقق من قبل المسوخ الفسفرة.
Introduction
فوسفهوريلات البروتين في بقايا محددة يلعب دورا هاما في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. وهكذا، يتطلب فهم شبكات التشوير تحديد مواقع فسفرة معينة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن موقع الفسفرة يحدد تأثير على وظيفة البروتين لأن المجالات الفردية داخل البروتين تمتلك هياكل ووظائف مختلفة. نشاط العامل النووي 2 عامل ذات الصلة 2 (Nrf2)، عامل النسخ المضادة للأكسدة الرئيسية، هو ثنائي الاتجاه ينظم من خلال الفسفرة في مواقع مختلفة. وقد ركزت دراساتنا على الكينازات التي تحفز الفسفرة من Nrf2. استجابة الضغط من Nrf2 ضد التحدي التأكسدي يحدث بسرعة، وذلك أساسا من خلال الفسفرة في سيرين 40 و بوساطة بروتين كيناز C (ييك) -δ، الذي ينشط Nrf2 3 ، 4 . على العكس، فان يحفز الفسفرة المثبطة من Nrf2 في التيروزين 568 للرقابة الصارمة على النشاط 5 .
الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لاكتشاف مواقع الفسفرة هي التحليل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي (لك / مس). يمكن إنشاء بيانات رسم الخرائط الموقع الفسفوري السريع وحساسة للغاية بهذه الطريقة. ومع ذلك، فقد العديد من القيود التقنية، وغالبا ما تولد إشارات سلبية كاذبة. وغالبا ما يحدث تغطية متوالية ضعيفة في تحليل لك / مس. لتحديد مواقع الفسفرة، مطلوب معلومات عن أقصى تغطية الأحماض الأمينية للبروتين 6 . انحلال البروتين من الاهتمام مع العديد من البروتياز خلال خطوة الهضم قد يكون من المساعدة في تحسين تغطية تسلسل. عقبة أخرى لتحديد بقايا الفسفرة هو فقدان الوجه من حامض الفوسفوريك التي كثيرا ما لوحظ لببتيدات السيرين و ثريونين فسفوريلاتد 6 ، 7 . غالبا ما تكون شقوق الفوسفات المعويةصدر من فوسفوببتيدس خلال عملية تجزئة 7 . الخيار الثاني عند البحث عن مواقع الفسفرة يستخدم طريقة ميكروأري الببتيد. فمن الممكن للشاشة للمواقع المستهدفة كيناز باستخدام شريحة ميكروأري تحتوي على شظايا الببتيد المستمدة من بروتين من الفائدة. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى متطلبات المعدات لإنتاج والكشف عن رقاقة ميكروأري، وتعتبر طريقة ميكروأري الببتيد تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.
للتغلب على هذه التحديات، يمكن أن تستخدم في المختبر أوليغوبيبتيد تنافس مقايسة كيناز لكيناز البروتين مع زخارف معروفة الاعتراف. إذا تم إنشاء عزر الاعتراف بالإجماع من كيناز، يمكن توقع مواقع فسفوريلاتيون المفترضة من الركيزة مرشح، ويمكن التحقق من صحة المواقع. الطريقة الأكثر إقناعا لهذا الإجراء هو إظهار إلغاء الفسفرة في بروتين متحولة التي التنبؤد بقايا مع حمض أميني غير فسفوري ( أي سيرين أو ثريونين إلى ألانين؛ التيروزين إلى فينيل ألانين). ومع ذلك، فإن إنتاج وعزلة البروتينات متحولة تستغرق وقتا طويلا. كبديل في المرحلة الأولى من البحث، والببتيد اختبار كيناز الببتيد هو واضح ومريح. هنا، نحن تصف بروتوكول لفي المختبر فحص الببتيد المنافسة وللتحقق من موقع الفسفرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كطريقة بسيطة ومريحة لتقييم أصالة مواقع الفسفرة المتوقعة بوساطة أمك، هنا نحن تصف في المختبر فحص كيناز التي يمكن استخدامها لاكتشاف موقع فسفرة معينة باستخدام الببتيدات تنافسية والتحقق من ذلك باستخدام متحولة موقع معين . البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها من <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الوطنية من كوريا منحة بتمويل من الحكومة الكورية (مسيب) (رقم 2015R1A2A1A10052663 ورقم 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol | Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
