Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi
Summary
Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.
Abstract
DNA hasarına tepki, kendiliğinden oluşan, genotoksik stresin neden olduğu DNA lezyonlarının onarımını düzenler veya lenfositlerde programlanmış DNA kopmaları bağlamında görülür. Ataksi-Telenjiektazi Mutasyona uğramış kinaz (ATM), ATM ve Rad3-İlgili kinaz (ATR) ve DNA'ya bağlı Protein Kinaz'ın (DNA-PKcs) katalitik altbirimi DNA hasarının indüksiyonu üzerine aktive edilen ilk maddeler arasındadır ve DNA onarımını, apoptozu ve hücre sağkalımını kontrol eden bir ağın merkezi regülatörleri. Bir tümör baskılayıcı yolağın bir parçası olarak, ATM ve ATR p53'ü fosforilasyon yoluyla aktive ederek p53'ün transkripsiyonel aktivitesini düzenler. DNA hasarı da, DNA hasar alanındaki birikir DNA hasar sensörü ve onarım proteinlerinin komplekslerini temsil eden iyonize edici radyasyona neden olan odakların (IRIF) oluşumuyla sonuçlanır; bunlar, floresan mikroskobu ile görselleştirilir. Bununla birlikte, IRIF'lerdeki proteinlerin birlikte lokalizasyonu mutlaka dFloresan mikroskopisinin çözünürlüğü sınırlı olduğu için, protein-protein etkileşimlerini geliştirin.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA), benzeri görülmemiş özgünlük ve duyarlılıkla hücrelerdeki ve dokulardaki protein-protein etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan yeni bir tekniktir. Bu teknik ilgi proteinlerine spesifik antikorların uzaysal yakınlığına dayanır. Sorgulanan proteinler 40 nm'de olduğunda, bir amplifikasyon reaksiyonu, antikorlara konjuge edilmiş oligonükleotidler tarafından tetiklenir ve amplifikasyon ürünü, etkileşen proteinlerin subselüler konumuna karşılık gelen bir sinyal veren floresan etiketleme yoluyla görselleştirilir. Örnek olarak ATM ve p53 arasında kurulan işlevsel etkileşimi kullanarak burada PLA'nın DNA hasar yanıtının ayrılmaz parçaları olan proteinler arasındaki doğrudan etkileşimleri incelemek için süspansiyon hücre kültürlerinde nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.
Introduction
DNA hasarı, protein-protein etkileşimleri ve DNA'nın etkin ve hızlı onarımını sağlayan translasyon sonrası modifikasyonlar içeren ve genomik bütünlüğünü koruyan, oldukça düzenlenen bir dizi olayı tetikler. Tipik olarak, DNA onarımı (konfokal) flüoresan mikroskopisi ile iyonize edici radyasyona bağlı odakların (IRIF) oluşumunu izleyerek iyonize radyasyona maruz kalan hücrelerde incelenir. Birçok DNA onarımı ve DNA hasar algılayan proteinler, DNA hasarını sürdüren kromatin bölgelerinde çekirdekleşen protein komplekslerini temsil eden IRIF'leri oluşturur 2 , 3 . IRIF'lerin zaman içindeki yeri ve çözünümü, DNA onarımının spatiotemporal düzenlenmesi ile ilgili önemli bilgiler verir ve farklı DNA onarım yollarının katılımını gösterebilir. Hasar görülen DNA hasarının ve hücre döngüsünün evresi hangi DNA onarım yolunun aktive edildiğini belirler. fo R örneğinde aktif olarak DNA kopyalama (S fazı) yapan hücrelerde homolog rekombinasyon (HR) dominant DNA tamir yoludur, oysa hücre döngüsünün G1- veya G2 / M-fazındaki hücrelerde, Homolog son katılma (NHEJ) onarım yolu baskın. DNA hasarını takiben en erken olaylardan biri, çoğunlukla hücre döngüsünün G1 ve G2 / M fazlarında aktif olan ve NHEJ'i düzenleyen DNA hasar algılayan kinazların hareketsiz kılınması olan Ataksi Telenjiektazi Mutasyonlu protein (ATM) Ve Ataxia Telangiectasia ve HR'yi aktive ederek S fazında hareket eden Rad3 ile ilgili protein (ATR). Hem ATM hem de ATR, DNA onarımı, hücre ölümü ve hayatta kalma 4 ile ilgili birçok proteini fosforile eden çok pleiotropik kinazlardır. Her iki kinazın da genotoksik strese maruz kaldıktan sonra p53 tümör süpresör proteinini fosforile ettiği ve aktive ettiği gösterilmiştir; bu kinazlar, pivotal bir tümör baskılayıcı sinyal ekseni"Xref"> 5 , 6 .
IRIF'lerin oluşumu ve bileşimi tipik olarak, çift renkli immünofloresan boyama ve mikroskopi kullanılarak farklı proteinlerin birlikte lokalizasyonunun belirlenmesiyle değerlendirilir; bununla birlikte, onarım protein komplekslerinin bir parçası olan tüm proteinler, bu yaklaşımın uygulanabilirliğini sınırlayan IRIF'leri oluşturmaz. Dahası, (konfokal) immünofloresan mikroskopisi, ışığın kırınım özellikleri ile sınırlandırılır ve yaklaşık 200-300 nm'lik oldukça zayıf bir uzaysal çözünürlük ile sonuçlanır ve çoğu hücre içi yapının boyutunu aşar ve esasen protein-protein etkileşimlerinin doğrudan sorgulanmasını engeller Moleküler seviyesi. Bu nedenle, (konfokal) floresan mikroskopisi ile tespit edilen immünofloresan boyama modellerinin birlikte lokalizasyonu doğrudan protein-protein etkileşimleri için bir gösterge değildir. Son zamanlarda, üç boyutlu yapı gibi yeni süper çözünürlük teknolojileri geliştirildiKonfokal lazer taramalı mikroskopi 8 ile tespit edilemeyen bu proteinlerin mekansal dağılım özelliklerini ortaya çıkaran, 53BP1 ve BRCA1 IRIF oluşumunu nano ölçekli detaylı olarak incelemek için başarıyla kullanılan tüylü aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) 7'yi test etti.
İmmünopresipitasyon, çekme metodları ve maya iki hibrid tarama yaklaşımları gibi in vivo protein-protein etkileşimlerini saptamak için başka birçok yöntem kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler oldukça hantaldır, büyük miktarlarda hücre veya protein gerektirir veya deneysel eserler getiren proteinlerin aşırı ekspresyonunu içerir. Yakın bir zamanda, Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 olarak adlandırılan yerinde ( yani hücrelerde ve dokularda) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini ve nicelenmesini sağlayan yeni bir teknik geliştirildi. PrIlgili iki proteini tanıyan immün antikorlar, oligonükleotidlere konjuge edilmiş ikincil antikorlar (PLA probları olarak adlandırılır) tarafından tespit edilir. İki farklı ikincil antikor, primer antikorlar tarafından tanınan proteinler arasındaki etkileşimler nedeniyle yeterince yakınsa, konjüge edilmiş oligonükleotidler hibridize olur ve bir kapalı dairesel DNA substratı oluşturmak üzere bağlanabilir. Bu dairesel substrat daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile büyütülür ve florokrom-konjüge tamamlayıcı oligonükleotitler ile görselleştirilir. PLA kullanılarak, protein-protein etkileşiminin subselüler lokalizasyonu, floresan etiketli yuvarlanan daire yükseltme-ürünü PLA problarına bağlı kaldığı için korunur. Bu testin çözünürlüğü, bir antikor çapının yaklaşık 7-10 nm 11 olduğu bulgusuna dayanarak <50 nm'dir. Haddeleme dairesi amplifikasyonu ancak iki çift antikor (birincil + seconDary), boyutları (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) ile tanımlanan çevre içerisinde fiziksel olarak etkileşime girer. Sinyal yükseltme basamağı, PLA tahlilinin duyarlılığını arttırır ve az miktarda eksprese edilen proteinlerin etkileşimlerinin saptanmasını sağlar. PLA, hücre bazında nicelleştirilebilen, protein-protein etkileşimlerindeki hücre içi ve hücreler arası değişimi değerlendirilebilecek noktasal, odaklar benzeri sinyal kalıpları üretir.
DNA tamir kompleksleri ve IRIF'lerin oluşumu ve bileşimi, insan kemik osteosarkom epitel hücre hattı U2OS, insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293 ve retinal pigment epitelyal hücre hattı RPE-1 gibi hızlı yapışan hücre hatlarında, Büyümek ve transfekte etmek kolaydır. Süspansiyon hücre kültürleri böyle bir lenfoid ve miyeloid hücre dizisi daha az kullanılır, çünkü bunlar transfeksiyona daha az yatkındır ve genellikle lamelleri tutmaz, bu nedenle ek / alternatif st gerektirirGörüntüleme için eps. Ancak DNA hasarının cevabı lenfoid ve miyeloid maligniteler bağlamında çok önemlidir çünkü DNA hasar tepkisi, bu tümörlerde genomik (sürücü) sapmalar tarafından sıklıkla etkilenir ve normal lenfoid ve miyeloid malign transformasyonunda önemli bir rol oynamaktadır ( Progenitör) hücreler 12 , 13 , 14 .
Bu protokol, süspansiyon hücre kültürlerinde DNA hasarının indüklenmesinden sonra protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek ve ölçmek için PLA'nın nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Burada, PLA, bir G1-fazlı hücre döngüsü tutuklanmasına neden olan insan B-hücresi lösemi hücrelerinde, DNA hasarı üzerine ATM ve p53 arasındaki etkileşimleri belirlemek ve görselleştirmek için gerçekleştirilir. Burada verilen protokol, G1 ile tutuklanan lösemi hücrelerinde ATM ve p53 etkileşimlerinin incelenmesi ile sınırlı değildir, ancak diğer protein-protein interaktılarını da görselleştirmek için kullanılabilirÇeşitli hücre tiplerinde ve süspansiyon hücre kültürlerinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, süspansiyon hücre kültürlerinde proteinler arasındaki spesifik etkileşimi belirlemek ve görselleştirmek için PLA'nın kullanılabileceği gösterilmiştir. Not burada, burada açıklanan protokol, DNA tamir kompleksleri çalışması ile sınırlı değildir, aynı zamanda süspansiyon hücre kültürlerinde diğer protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek için de geçerlidir. ATM kinazı, bir DNA hasarını tetikleyen ajana maruz bırakıldığında G1 ile tutuklanmış BC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Guikema laboratuarında yapılan araştırmalar, Hollanda Bilimsel Araştırmalar Örgütü (VIDI hibesi 016126355) ve 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (proje 252) 'nin Yenilikçi Araştırma Teşvik Planı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
