Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

O dano do DNA desencadeia uma série altamente regulada de eventos envolvendo interações proteína-proteína e modificações pós-tradução que garantem o reparo eficiente e rápido do DNA, salvaguardando assim a integridade genômica ¹ . Tipicamente, o reparo do DNA é estudado em células expostas à radiação ionizante, monitorando a formação dos chamados focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) por microscopia de fluorescência (confocal). Muitas proteínas de detecção e detecção de dano do DNA formam IRIFs, que representam complexos de proteínas que nucleam em locais de cromatina sustentando dano de DNA ^{2 , 3} . A localização e a resolução dos IRIF ao longo do tempo fornecem uma visão importante da organização espaciotemporal do reparo do DNA e podem indicar o envolvimento de diferentes caminhos de reparo do DNA. A natureza do dano do DNA eo estágio do ciclo celular em que o dano é atingido determinam qual caminho de reparo do DNA é ativado. Fo Por exemplo, em células ativamente envolvidas na replicação de DNA (fase S), a recombinação homóloga (HR) é a via de reparo do DNA dominante, enquanto que nas células na fase G1 ou G2 / M do ciclo celular, a célula não- É predominante a via de reparo homóloga de junção final (NHEJ). Um dos primeiros eventos após o dano do DNA é a ativação das cinases sensíveis ao dano do DNA Ataxia Telangiectasia-proteína mutada (ATM), que é principalmente ativa nas fases G1 e G2 / M do ciclo celular e regula o NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Proteína Relacionada a Rad3 (ATR), que atua em fase S ativando a FC. Ambos ATM e ATR são quinases muito pleiotrópicas que fosforilam muitas proteínas envolvidas no reparo do DNA, morte celular e sobrevida ⁴ . Ambas as quinases demonstraram fosforilar e ativar a proteína supressora de tumores p53 após a exposição ao estresse genotóxico, indicando que essas cinases são mediadores a montante de um eixo de sinalização de supressão de tumor fundamental"Xref"> 5 ^{, 6} .

A formação e a composição dos IRIFs são tipicamente avaliadas pela determinação da co-localização de diferentes proteínas usando coloração e microscopia de imunofluorescência de duas cores, no entanto, nem todas as proteínas que fazem parte dos complexos de proteínas de reparo formam IRIFs, o que limita a aplicabilidade desta abordagem. Além disso, a microscopia de imunofluorescência (confocal) é limitada pelas propriedades de difracção da luz, resultando em uma resolução espacial bastante fraca de cerca de 200-300 nm, excedendo o tamanho da maioria das estruturas subcelulares, o que essencialmente proíbe a interrogação direta das interações proteína-proteína ao O nível molecular. Como tal, a co-localização de padrões de coloração de imunofluorescência como detectada por microscopia de fluorescência (confocal) não é necessariamente indicativa de interações diretas proteína-proteína. Recentemente, novas tecnologias de super-resolução foram desenvolvidas, como a estrutura tridimensionalMicroscopia de iluminação tingida (3D-SIM) ⁷ , que foi utilizada com sucesso para estudar a formação de IRF de 53BP1 e BRCA1 em detalhes de nano-escala, revelando as características de distribuição espacial dessas proteínas que não foram detectadas por microscopia confocal de varredura a laser ⁸ .

Vários outros métodos podem ser usados ​​para detectar interações proteína-proteína in vivo , tais como métodos de co-imunoprecipitação, pull-down e abordagens de rastreio de dois híbridos de fermento. No entanto, essas técnicas são bastante pesadas, exigem grandes quantidades de células ou proteínas ou envolvem a superexpressão de proteínas, que introduzem artefatos experimentais. Mais recentemente, desenvolveu-se uma nova técnica que permite a visualização e quantificação de interações proteína-proteína in situ ( isto é, nas células e nos tecidos), denominada Ensaio de Ligação Proxima (PLA) ^{9 , 10} . PrOs anticorpos imateriais que reconhecem duas proteínas de interesse são detectados por anticorpos secundários que são conjugados com oligonucleótidos (as chamadas sondas PLA). Se os dois anticorpos secundários diferentes forem suficientemente próximos devido às interacções entre as proteínas reconhecidas pelos anticorpos primários, os oligonucleótidos conjugados hibridam e podem ser ligados para formar um substrato de ADN circular fechado. Este substrato circular é subsequentemente amplificado por amplificação do círculo circulante e visualizado com oligonucleótidos complementares conjugados com fluorochrome. Usando PLA, a localização subcelular da interação proteína-proteína é preservada à medida que o produto de amplificação do círculo de rolamento com marcação fluorescente permanece ligado às sondas PLA. A resolução deste ensaio é <50 nm, com base no achado de que o diâmetro de um anticorpo é de aproximadamente 7-10 nm ¹¹ . A amplificação do círculo circulante só pode ocorrer no caso de dois pares de anticorpos (primário + segundo planoDary) interagem fisicamente dentro do perímetro que é definido pelo seu tamanho (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). O passo de amplificação do sinal aumenta a sensibilidade do ensaio de PLA e permite a detecção de interações de proteínas raramente expressas. O PLA gera padrões de sinais pontuais e focos que podem ser quantificados por célula, pelo qual a variação intra e intercelular nas interações proteína-proteína pode ser avaliada.

A formação e composição de complexos de reparo de DNA e IRIFs são principalmente estudadas em linhas celulares aderentes, como a linha celular epitelial de osteossarcoma de osso humano U2OS, a linha de células de rim embrionárias humanas HEK293 e a linha de células epiteliais de pigmento retiniano RPE-1, Crescente e fácil de transfectar. As culturas de células de suspensão, tais como linhagens linfóides e mieloides, são usadas com menos frequência, uma vez que estas são menos favoráveis ​​à transfecção e, em geral, não aderem aos lamínulas, exigindo, assim, uma alternativa adicionalEps para imagens. A resolução do dano do DNA é, no entanto, muito relevante no contexto de malignidades linfóides e mielóides, uma vez que a resposta ao dano do DNA é freqüentemente afetada por aberrações genômicas (excitadores) nesses tumores, desempenhando um papel fundamental na transformação maligna de linfóides e mieloides normais ( Células progenitoras ^{12 , 13 , 14} .

Este protocolo descreve como o PLA pode ser usado para avaliar e quantificar as interações proteína-proteína após a indução do dano do DNA em culturas de células em suspensão. Aqui, o PLA é realizado para determinar e visualizar as interações entre ATM e p53 após o dano do DNA em células de leucemia de células B humanas que são induzidas a sofrer uma parada do ciclo celular em fase G1. De notar que o protocolo aqui apresentado não se restringe ao estudo de interações ATM e p53 em células de leucemia detidas por G1, mas também pode ser usado para visualizar outras proteínas-proteína interativaEm vários tipos de células e culturas de células suspensas.