Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Il danno del DNA innesca una serie altamente regolamentata di eventi che coinvolgono le interazioni proteico-proteiche e le modificazioni post-traslazionali che garantiscono una riparazione efficiente e rapida del DNA, salvaguardando così l'integrità genomica ¹ . In genere, la riparazione del DNA viene studiata in cellule esposte a radiazioni ionizzanti monitorando la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) mediante microscopia a fluorescenza (confocale). Molte protezioni del DNA e proteine ​​che danno i danni del DNA formano IRIFs, che rappresentano complessi proteici che nucleate nei siti di cromatin che sostengono il danno del DNA ^{2 , 3} . L'ubicazione e la risoluzione degli IRIF nel corso del tempo danno un'importante conoscenza dell'organizzazione spaziale della riparazione del DNA e possono indicare il coinvolgimento di diversi percorsi di riparazione del DNA. La natura del danno del DNA e la fase del ciclo cellulare in cui il danno è raggiunto determina quale percorso di riparazione del DNA è attivato. fo R, in cellule attivamente impegnate nella replicazione del DNA (fase S), la ricombinazione omologa (HR) è il percorso di riparazione dominante del DNA, mentre nelle cellule nella fase G1 o G2 / M del ciclo cellulare, Predominano il percorso di riparazione homologous end-joining (NHEJ). Uno degli eventi più iniziali che segue il danno del DNA è l'attivazione delle proteine ​​della telangiectasia-mutato (ATM) di Ataxia Telangiectasia-Mutated (ATM), che è prevalentemente attiva nelle fasi G1 e G2 / M del ciclo cellulare e regola NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Rad3-related protein (ATR), che agisce in fase S attivando HR. Entrambi ATM e ATR sono cinasi molto pleiotropici che fossicole molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA, nella morte cellulare e nella sopravvivenza ⁴ . Entrambe le chinasi sono state dimostrate di fosforilazione e attivazione della proteina tumor-suppressor p53 a seguito dell'esposizione a stress genotossico, indicando che queste chinasi sono mediatori a monte di un asse di segnalazione suppressivo del tumore pivotal"Xref"> 5 ^{, 6} .

La formazione e la composizione degli IRIF è tipicamente valutata determinando la co-localizzazione di diverse proteine ​​usando la colorazione immunofluorescenza a due colori e la microscopia, tuttavia non tutte le proteine ​​che fanno parte dei complessi proteici di riparazione formano IRIF che limita l'applicabilità di questo approccio. Inoltre, la microscopia di immunofluorescenza (confocale) è limitata dalle proprietà di diffrazione della luce, con una risoluzione spaziale piuttosto scarsa di circa 200-300 nm, superando le dimensioni delle strutture subcellulari più basse, il che proibisce essenzialmente l'interrogazione diretta delle interazioni protein-proteine ​​a Il livello molecolare. Come tale, la co-localizzazione dei modelli di colorazione delle immunofluorescenza rilevata dalla microscopia a fluorescenza (confocale) non è necessariamente indicativa per le interazioni proteiche-proteiche dirette. Recentemente, sono state sviluppate nuove tecnologie super-risoluzione, come ad esempio strutture struzionali tridimensionali(3D-SIM) ⁷ , che è stato utilizzato con successo per studiare la formazione di IRBF 53BP1 e BRCA1 a dettagli di nano scala, rivelando le caratteristiche di distribuzione spaziale di queste proteine ​​che non sono state rilevate dalla microscopia a scansione laser a confocale ⁸ .

Molti altri metodi possono essere utilizzati per rilevare interazioni protein-proteine in vivo , quali co-immunoprecipitazione, metodi di abbattimento e approcci di screening a due hibridi di lievito. Tuttavia, queste tecniche sono piuttosto ingombranti, richiedono grandi quantità di cellule o proteine ​​o coinvolgono un'eccessiva espressione delle proteine, che introduce artefatti sperimentali. Più di recente è stata sviluppata una nuova tecnica che consente la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni proteiche-proteiche in situ ( cioè nelle cellule e nei tessuti), chiamata Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} . PrGli anticorpi secondari che riconoscono due proteine ​​di interesse sono rilevati da anticorpi secondari che sono coniugati a oligonucleotidi (cosiddette sonde PLA). Se i due diversi anticorpi secondari sono sufficientemente stretti a causa delle interazioni tra le proteine ​​riconosciute dagli anticorpi primari, gli ioligonucleotidi coniugati si ibridano e possono essere legati per formare un substrato DNA circolare chiuso. Questo substrato circolare viene successivamente amplificato mediante amplificazione a circuito circolare e visualizzata con oligonucleotidi complementari con fluorochrome. Utilizzando PLA, la localizzazione subcellulare dell'interazione proteico-proteica viene mantenuta quando il prodotto di amplificazione del cerchio di laminazione a fluorescenza è rimasto collegato alle sonde PLA. La risoluzione di questo saggio è <50 nm, basata sulla constatazione che il diametro di un anticorpo è di circa 7-10 nm ¹¹ . L'amplificazione del cerchio rotante può avvenire solo nel caso in cui due paia di anticorpi (primario + seconDary) interagiscono fisicamente all'interno del perimetro definito dalla loro dimensione (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La fase di amplificazione del segnale aumenta la sensibilità del test PLA e consente la rilevazione delle interazioni di proteine ​​appena espresse. PLA genera segnali di punta, simili a foci simili, che possono essere quantificati su base cellulare per cui è possibile valutare la variazione intra-cellulare e inter-cellulare nelle interazioni proteico-proteine.

La formazione e la composizione dei complessi di riparazione e IRIF sono principalmente studiati in linee cellulari aderenti come la linea cellulare U2OS osteosarcoma ossea umana, la linea cellulare HEK293 embrionale umana e la linea cellulare epiteliale RPE-pigment retinica, Crescente e facile da trasfettare. Le colture di cellule di sospensione, come quelle lineari di linfoidi e mieloidi, vengono utilizzate meno frequentemente, poiché queste sono meno suscettibili alla trasfezione e generalmente non si adattano a coverlips, richiedendo quindi ulteriori / alternative stEps per l'imaging. La risoluzione dei danni del DNA è però molto rilevante nel contesto delle malignità linfoidi e mieloide, in quanto la risposta dei danni al DNA è spesso influenzata dalle aberrazioni genomiche (driver) in questi tumori, svolgendo un ruolo fondamentale nella trasformazione maligna di linfoidi e mieloidi normali ( Progenitori) le cellule ^{12 , 13 , 14} .

Questo protocollo descrive come il PLA possa essere utilizzato per valutare e quantificare le interazioni proteico-proteiche dopo l'induzione del danno del DNA nelle colture di cellule di sospensione. Qui, PLA viene eseguita per determinare e visualizzare le interazioni tra ATM e p53 sul danno del DNA nelle cellule di leucemia delle cellule umane B che sono indotte a subire un arresto del ciclo cellulare in fase G1. Da notare, il protocollo qui presentato non è limitato allo studio di interazioni ATM e p53 nelle cellule di leucemia arrestate da G1, ma può anche essere utilizzato per visualizzare altri interazioni proteico-proteicoIn vari tipi di cellule e colture di cellule di sospensione.