איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה
Summary
הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.
Abstract
תגובת הנזק לדנ"א מנצלת את תיקון נגעי הדנ"א המתרחשים באופן ספונטני, נגרמת על ידי לחץ גנוטוקסי, או מופיעים בהקשר של הפסקות DNA מתוכנות בלימפוציטים. הטכנולוגיות של קינאז מוטאקס (ATM-ATM) ו- Ataxia-Telangiectasia מוטציות (ATM), ATM ו- Rad3-Related קינאז (ATR) ומקטע קטליטי של פרוטאין קינאז (DNA-PKcs) תלויי DNA, הם בין הראשונים המופעלים על גבי אינדוקציה של נזק ל- DNA, והם רגולטורים מרכזיים של רשת השולטת בתיקון דנ"א, אפופטוזיס והישרדות תאים. במסגרת מסלול מדכא גידול, כספומט ו- ATR מפעילים את p53 דרך זרחון, ובכך מסדירים את הפעילות התעתיקית של p53. נזקי דנ"א גורמים גם להיווצרות של מוקדי קרינה מייננת (IRIF) המייצגים קומפלקסים של חיישן נזקי דנ"א וחלבוני תיקון המצטברים באתרים של נזק ל- DNA, אשר מדמיינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיתוף לוקליזציה של חלבונים ב- IRIFs, לעומת זאת, לא בהכרח אומר dאינטראקציה חלבונים אינטראקציה חלבון, כמו ברזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוגבל.
באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) היא טכניקה חדשה המאפשרת הדמיה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים בתאים ורקמות עם סגוליות ורגישות חסרות תקדים. טכניקה זו מבוססת על הקרבה המרחבית של נוגדנים ספציפיים המחייבים את החלבונים המעניינים. כאשר החלבונים הנחקרים הם בתוך ~ 40 ננומטר תגובת הגברה מופעלת על ידי oligonucleotides כי הם מצומדות לנוגדנים, ואת המוצר הגברה הוא דמיינו על ידי תיוג פלורסנט, מניב אות המתאים למיקום subcellular של חלבונים אינטראקציה. באמצעות אינטראקציה תפקודית הוקמה בין כספומט p53 כדוגמה, הוא הוכיח כאן כיצד PLA ניתן להשתמש בתרבויות תא ההשעיה כדי לחקור את האינטראקציות הישירות בין חלבונים שהם חלקים בלתי נפרד של התגובה נזק DNA.
Introduction
נזק ל- DNA גורם לסדרת אירועים מבוקרת ביותר, הקשורים לאינטראקציות בין חלבונים לחלבון ולשינויים שלאחר טרנסלוציוניים המבטיחים תיקון יעיל ומהיר של ה- DNA, ובכך שומרים על שלמות גנומית. בדרך כלל, תיקון דנ"א נחקר בתאים שנחשפו לקרינה מיננת על ידי ניטור היווצרות של מה שמכונה קרינה מיננת- fuci המושרה (IRIF) על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תיקון DNA רבים ו DNA חישה חלבונים חישה IRIFs, המייצגים קומפלקסים חלבונים כי נוקלאט באתרי הכרומטין נזק DNA 2 , 3 . המיקום והרזולוציה של IRIFs לאורך זמן מעניקים תובנה חשובה לארגון spatiotemporal של תיקון DNA, ועשויים להצביע על מעורבותם של מסלולי תיקון דנ"א שונים. אופי הנזק לדנ"א ושלב מחזור התא שבו מתקבל הנזק קובע איזה מסלול תיקון דנ"א מופעל. Fo R), בתאים המעורבים באופן פעיל בשכפול דנ"א (S-phase), רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מסלול תיקון דנ"א דומיננטי, ואילו בתאים בשלב G1 או G2 / M של מחזור התא, הומולוגיים end-joining (NHEJ) מסלול תיקון שולטת. אחד האירועים המוקדמים ביותר בעקבות נזק ל- DNA הוא ההפעלה של ה- DNA חישה נזק קינאזות Ataxia Telangiectasia- מוטציה חלבון (ATM), אשר פעיל בעיקר G1 ו- G2 / M- שלבי מחזור התא מסדיר NHEJ, ו Ataxia Telangiectasia ו Rad3 הקשורות חלבון (ATR), אשר פועל בשלב S על ידי הפעלת HR. שניהם ATM ו ATR הם קינאזות pleiotropic מאוד כי phosphorylate חלבונים רבים המעורבים תיקון דנ"א, מוות תאים הישרדות 4 . שני קינאזות הוכחו phosphorylate ולהפעיל את חלבון מדכאי הגידול p53 בעקבות החשיפה ללחץ genotoxic, המציין כי קינאזות אלה הם מתווכים במעלה של ציר מרכזי דיכוי איתות מדכא"Xref"> 5 , 6 .
היווצרות והרכב של IRIFs מוערכת בדרך כלל על ידי קביעת שיתוף לוקליזציה של חלבונים שונים באמצעות צבע כפול immunofluorescence מכתים מיקרוסקופיה, עם זאת, לא כל החלבונים שהם חלק ממתקני חלבון לתקן טופס IRIFs, אשר מגביל את תחולתה של גישה זו. יתר על כן, מיקרוסקופיה immunocalluorescence (confocal) immunofluorescence מוגבל על ידי תכונות עקיפה של האור, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית גרועה למדי של כ 200-300 ננומטר, עולה על גודל של מבנים תת ביותר, אשר למעשה אוסר על חקירה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים ב ברמה המולקולרית. ככזה, שיתוף לוקליזציה של דפוסים מכתים immunofluorescence כפי שזוהו על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו בהכרח אינדיקציה אינטראקציות חלבונים ישיר. לאחרונה, פיתחו טכנולוגיות חדשות ברזולוציה גבוהה, כגון תלת מימדי struc(3D-SIM) 7 , אשר שימש בהצלחה ללמוד 53BP1 ו BRCA1 IRIF היווצרות בקנה מידה ננו בקנה מידה, חושפים את המאפיינים ההפצה המרחבית של חלבונים אלה שלא ניתן לזהות ידי מיקרוסקופ לייזר confocal 8 סריקה.
שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון חלבון in vivo , כגון שיתוף immunoprecipitation, משיכה שיטות ושמרים שתי היברידית גישות ההקרנה. עם זאת, טכניקות אלה הם מסורבלים למדי, דורשים כמויות גדולות של תאים או חלבונים או לערב overexpression של חלבונים, אשר מציג חפצים ניסיוניים. לאחרונה, פותחה טכניקה חדשה המאפשרת להדמיה וכימות של אינטראקציות חלבונים-חלבון באתרו ( כלומר בתאים וברקמות), אשר נקראת Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . יחסי ציבורנוגדנים אימריים המזהים שני חלבונים בעלי עניין מזוהים על ידי נוגדנים משניים המצמידים לאוליגונוקליוטידים (מה שמכונה בדיקות PLA). אם שני נוגדנים משני שונים קרובים מספיק בשל אינטראקציות בין החלבונים המוכרים על ידי נוגדנים ראשוניים, oligonucleotides מצומדות הכלאה יכול להיות ligated כדי ליצור מצע דנ"א סגור עגול. זה המצע העגול מוגבר לאחר מכן על ידי הגברה מעגל מתגלגל, ו דמיינו עם oligonucleotides fluorochrome- מצומדות מצומדות. באמצעות PLA, לוקליזציה subcellular של אינטראקציה חלבון חלבון נשמר כמו fluorescently שכותרתו מתגלגל מעגל הגברה המוצר נשאר מחובר בדיקות PLA. הפתרון של assay זה הוא <50 ננומטר, על פי הממצא כי קוטר של נוגדנים הוא כ 7-10 ננומטר 11 . הגברה מעגל מתגלגל יכול להתרחש רק במקרה שני זוגות של נוגדנים (ראשוני + seconDary) אינטראקציה פיזית בתוך ההיקף המוגדר על ידי גודלם (10 + 10 + 10 + 10 = 40 ננומטר). צעד הגברה האות מגביר את הרגישות של assay PLA ומאפשר זיהוי של אינטראקציות של חלבונים לידי ביטוי בקושי. PLA מייצר דפוסי אותות הדוקים, דמויי foci שניתן לכמת על בסיס לכל תא, שבאמצעותם ניתן להעריך את השונות בין-תאית ובין-תאית באינטראקציות בין חלבונים לחלבון.
היווצרות והרכב של מתחמי תיקון דנ"א ו- IRIFs נחקרת בעיקר בקווים תאיים חסידים כגון עצם העצם האוסטלית של העצם אוסטיארקומה U2OS, קו תאי הכליה האנושי HEK293 וקו תא אפיתל פיגמנט ברשתית RPE-1, גדל וקל transfect. ההשעיה תא תרבויות כגון לימפה וקווים תא מיאלואידי נמצאים בשימוש בתדירות נמוכה יותר, שכן אלה פחות מקובל transfection ובדרך כלל לא לדבוק coverslips, ובכך דורש רחוב נוסף / אלטרנטיביEps עבור הדמיה. עם זאת, הרזולוציה של הנזק לדנ"א היא רלוונטית מאוד בהקשר של לימפה ומיאלואיד ממאירות, שכן תגובת הנזק לדנ"א מושפעת לעיתים קרובות מהפרעות גנומיות (נהגים) בגידולים אלה, וממלא תפקיד מרכזי בהפיכה הממאירה של לימפואיד ומיאלואיד ( בת) 12 , 13 , 14 .
פרוטוקול זה מתאר כיצד PLA ניתן להשתמש כדי להעריך לכמת אינטראקציות חלבון חלבון בעקבות אינדוקציה של נזק דנ"א בתרביות תאים ההשעיה. כאן, PLA מבוצעת כדי לקבוע ולדמיין את האינטראקציות בין כספומט p53 על נזק ל- DNA בתאי לוקמיה תאי B תאים אנושיים, כי הם המושרה לעבור מעגל מחזור תא שלב G1. שים לב, הפרוטוקול המוצג כאן אינו מוגבל ללימוד אינטראקציות כספומט ו- p53 בתאים לוקמיה G1, אבל יכול לשמש גם כדי לדמיין אחרים חלבון חלבון interacTions סוגי תאים שונים ותרבויות תאים ההשעיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדו"ח זה, הוא הוכיח כי PLA ניתן להשתמש כדי לקבוע לדמיין את האינטראקציה הספציפית בין חלבונים בתרבויות תא ההשעיה. ראוי לציין, הפרוטוקול המתואר כאן אינו מוגבל ללימוד מתחמי תיקון דנ"א, אלא גם חל על לדמיין לכמת אינטראקציות חלבונים אחרים חלבון בתרביות תאים ההשעיה. זה הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר במעבדה Guikema ממומן על ידי תוכנית תמריצים מחקר חדשני מארגון הולנד למחקר מדעי (VIDI מענק 016126355) ו 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (פרויקט 252).
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
