Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

DNA-Schaden löst eine hochregulierte Reihe von Ereignissen mit Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen aus, die die effiziente und schnelle Reparatur von DNA sicherstellen und damit die genomische Integrität sichern. Typischerweise wird die DNA-Reparatur in Zellen untersucht, die ionisierender Strahlung ausgesetzt sind, indem sie die Bildung von sogenannten ionisierenden Strahlung induzierten Herden (IRIF) durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie überwachen. Viele DNA-Reparatur- und DNA-Schmerz-Sensing-Proteine ​​bilden IRIFs, die Proteinkomplexe repräsentieren, die an Chromatinstellen anhalten, die DNA-Schäden ^{2 , 3} aufrechterhalten. Die Lage und Auflösung von IRIFs im Laufe der Zeit gibt einen wichtigen Einblick in die räumlich-zeitliche Organisation der DNA-Reparatur und kann auf die Beteiligung verschiedener DNA-Reparaturwege hindeuten. Die Art der DNA-Schädigung und die Zellzyklusstufe, in der der Schaden erreicht wird, bestimmt, welcher DNA-Reparaturweg aktiviert ist. Fo (OH) ist die dominante DNA-Reparaturbahn, während bei Zellen in der G1- oder G2 / M-Phase des Zellzyklus die nicht- Homologe Endverknüpfung (NHEJ) Reparaturpfad überwiegt. Eines der frühesten Ereignisse nach DNA-Schädigung ist die Aktivierung der DNA-Schmerz-Sensing-Kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutiertes Protein (ATM), das meist in den G1- und G2 / M-Phasen des Zellzyklus aktiv ist und NHEJ reguliert, Und Ataxia Telangiectasia und Rad3-verwandtes Protein (ATR), das in der S-Phase durch Aktivierung von HR wirkt. Sowohl ATM als auch ATR sind sehr pleiotrope Kinasen, die viele Proteine ​​phosphorylieren, die an der DNA-Reparatur, dem Zelltod und dem Überleben beteiligt sind ⁴ . Beide Kinasen haben gezeigt, dass sie das Tumorsuppressor-Protein p53 nach der Exposition gegenüber genotoxischem Stress phosphorylieren und aktivieren, was darauf hinweist, dass diese Kinasen stromaufwärts Vermittler einer schwenkbaren Tumorsuppressions-Signalisierungsachse sind"Xref"> 5 ^{, 6}

Die Bildung und Zusammensetzung von IRIFs wird typischerweise durch die Bestimmung der Co-Lokalisierung verschiedener Proteine ​​unter Verwendung von zweifarbiger Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie bestimmt, wobei jedoch nicht alle Proteine, die Teil von Reparaturproteinkomplexen sind, IRIFs bilden, was die Anwendbarkeit dieses Ansatzes begrenzt. Darüber hinaus ist die (konfokale) Immunfluoreszenzmikroskopie durch die Beugungseigenschaften von Licht begrenzt, was zu einer eher schlechten räumlichen Auflösung von etwa 200-300 nm führt, die die Größe der meisten subzellulären Strukturen übersteigt, was im Wesentlichen die direkte Vernehmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Das molekulare Niveau. Als solches ist die Co-Lokalisierung von Immunfluoreszenz-Färbemuster, wie sie durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden, nicht notwendigerweise für direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen indikativ. In letzter Zeit wurden neue Super-Resolution-Technologien entwickelt, wie zB dreidimensionale Strukturen(3D-SIM) ⁷ , die erfolgreich verwendet wurde, um die Bildung von 53BP1 und BRCA1 IRIF im nanoskaligen Detail zu untersuchen und die räumlichen Verteilungscharakteristiken dieser Proteine ​​aufzudecken, die durch konfokale Laserscanningmikroskopie nicht erkannt werden konnten ⁸ .

Mehrere andere Verfahren können verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu detektieren, wie Co-Immunpräzipitation, Pull-Down-Verfahren und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-Ansätze. Allerdings sind diese Techniken eher umständlich, erfordern große Mengen an Zellen oder Proteinen oder beinhalten eine Überexpression von Proteinen, die experimentelle Artefakte einführt. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Technik entwickelt, die die Visualisierung und Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ( dh in Zellen und in Geweben) ermöglicht, die als Proximity Ligation Assay (PLA) ^{9 , 10} bezeichnet ^wird . PrImary-Antikörper, die zwei interessierende Proteine ​​erkennen, werden von sekundären Antikörpern erkannt, die an Oligonukleotide (sogenannte PLA-Sonden) konjugiert sind. Wenn die beiden verschiedenen sekundären Antikörper aufgrund von Wechselwirkungen zwischen den von den primären Antikörpern erkannten Proteinen ausreichend eng sind, hybridisieren die konjugierten Oligonukleotide und können ligiert werden, um ein geschlossenes kreisförmiges DNA-Substrat zu bilden. Dieses kreisförmige Substrat wird anschließend durch Walzkreisverstärkung amplifiziert und mit fluorchrom-konjugierten komplementären Oligonukleotiden sichtbar gemacht. Unter Verwendung von PLA wird die subzelluläre Lokalisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung bewahrt, da das fluoreszenzmarkierte Rollkreis-Amplifikationsprodukt an den PLA-Sonden gebunden bleibt. Die Auflösung dieses Assays beträgt <50 nm, basierend auf dem Ergebnis, dass der Durchmesser eines Antikörpers etwa 7-10 nm ¹¹ beträgt. Die Walzkreisverstärkung kann nur stattfinden, wenn zwei Paare von Antikörpern (primär + sekDary) physisch interagieren innerhalb des Umfangs, der durch ihre Größe (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) definiert ist. Der Signalverstärkungsschritt erhöht die Empfindlichkeit des PLA-Assays und ermöglicht die Detektion von Wechselwirkungen von kaum exprimierten Proteinen. PLA erzeugt punktförmige, foci-ähnliche Signalmuster, die auf einer pro-Zell-Basis quantifiziert werden können, wodurch die intra- und interzelluläre Variation der Protein-Protein-Wechselwirkungen beurteilt werden kann.

Die Bildung und Zusammensetzung von DNA-Reparaturkomplexen und IRIFs wird meist in adhärenten Zelllinien wie der humanen Knochenosteosarkom-Epithelzelllinie U2OS, der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293 und der retinalen Pigmentepithelzelllinie RPE-1 untersucht, Wachsen und leicht zu verwandeln. Suspensionszellkulturen wie lymphoide und myeloide Zelllinien werden seltener eingesetzt, da diese weniger der Transfektion zugänglich sind und sich im Allgemeinen nicht an Deckgläschen haften und somit zusätzliche / alternative StEps für die Bildgebung. Die Auflösung von DNA-Schäden ist jedoch im Zusammenhang mit lymphatischen und myeloischen Malignitäten sehr relevant, da die DNA-Schadensreaktion häufig von genomischen (Treiber-) Aberrationen in diesen Tumoren betroffen ist und eine entscheidende Rolle bei der bösartigen Transformation von normalem lymphatischen und myeloiden ( Vorläufer) Zellen ^{12 , 13 , 14} .

Dieses Protokoll beschreibt, wie PLA verwendet werden kann, um Protein-Protein-Wechselwirkungen nach der Induktion von DNA-Schäden in Suspensionszellkulturen zu bewerten und zu quantifizieren. Hier wird PLA durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 auf DNA-Schäden in menschlichen B-Zell-Leukämiezellen zu bestimmen und zu visualisieren, die induziert werden, um einem G1-Phasen-Zellzyklus-Arrest zu unterziehen. Bemerkenswert ist, dass das hier vorgestellte Protokoll nicht auf das Studium von ATM- und p53-Interaktionen in G1-arrogierten Leukämiezellen beschränkt ist, sondern auch zur Visualisierung anderer Protein-Protein-Interac verwendet werden kannIn verschiedenen Zelltypen und Suspensionszellkulturen.