Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay
Summary
Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.
Abstract
De DNA schade respons respondeert de reparatie van DNA letsels die spontaan optreden, worden veroorzaakt door genotoxische stress, of verschijnen in het kader van geprogrammeerde DNA-breuken in lymfocyten. De Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- en Rad3-gerelateerde kinase (ATR) en de katalytische subeenheid van DNA-afhankelijke Protein Kinase (DNA-PKcs) behoren tot de eerste die geactiveerd worden bij inductie van DNA-schade en zijn Centrale regulatoren van een netwerk dat de reparatie van DNA, apoptose en celoverleving regelt. Als onderdeel van een tumoronderdrukkende weg activeert ATM en ATR p53 door fosforylering, waardoor de transcriptieve activiteit van p53 wordt geregeld. DNA schade resulteert ook in de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) die complexen van DNA schade sensor en reparatie eiwitten vertegenwoordigen die accumuleren op de sites van DNA schade, die worden weergegeven door fluorescentie microscopie. Co-lokalisatie van eiwitten in IRIF's impliceert echter niet noodzakelijkerwijs dIrect eiwit-eiwit interacties, aangezien de resolutie van fluorescentiemicroscopie beperkt is.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is een nieuwe techniek die de directe visualisatie van eiwit-eiwit interacties in cellen en weefsels mogelijk maakt met ongekende specificiteit en gevoeligheid. Deze techniek is gebaseerd op de ruimtelijke nabijheid van specifieke antilichamen die binden aan de eiwitten van belang. Wanneer de ondervraagde eiwitten binnen de 40 nm liggen, wordt een amplificatiereactie geactiveerd door oligonucleotiden die zijn geconjugeerd aan de antilichamen en het amplificatieproduct wordt door fluorescerende etikettering weergegeven, waardoor een signaal komt dat overeenstemt met de subcellulaire locatie van de interactieproteïnen. Met behulp van de gevestigde functionele interactie tussen ATM en p53 als voorbeeld, wordt hier aangetoond hoe PLA kan worden gebruikt in suspensiecelculturen om de directe interacties tussen eiwitten die integrale delen van de DNA-schaderespons zijn te bestuderen.
Introduction
DNA schade leidt tot een zeer gereguleerde reeks gebeurtenissen waarbij eiwit-eiwit interacties en post-translationele modificaties betrokken zijn die de efficiënte en snelle reparatie van DNA waarborgen, waardoor de genomische integriteit 1 wordt gewaarborgd. Typisch wordt DNA reparatie bestudeerd in cellen blootgesteld aan ioniserende straling door de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) door (confocale) fluorescentiemicroscopie te monitoren. Veel DNA-reparatie en DNA-schadebepalende eiwitten vormen IRIF's, die eiwitcomplexen vertegenwoordigen die nucleïneeren op chromatineplaatsen die DNA-schade 2 , 3 onderhouden. De locatie en de oplossing van IRIF's over de tijd geeft belangrijk inzicht in de spatiotemporale organisatie van DNA-reparatie, en kan de betrokkenheid van verschillende DNA-reparatiewegen aanduiden. De aard van de DNA-schade en het celcyclus stadium waarin de schade wordt bereikt, bepaalt welk DNA herstelpad wordt geactiveerd. fo In de cellen die actief betrokken zijn bij DNA-replicatie (S-fase) is homologe recombinatie (HR) de dominante DNA-herstelweg, terwijl in de cellen in de G1- of G2 / M-fase van de celcyclus de niet- Homologe end-joining (NHEJ) reparatiebaan overheersen. Een van de vroegste gebeurtenissen na DNA-schade is de activatie van de DNA-schade-senserende kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), die meestal actief is in de G1- en G2 / M-fasen van de celcyclus en NHEJ reguleert, En Ataxia Telangiectasia en Rad3-gerelateerde eiwitten (ATR), die in S-fase optreden door HR te activeren. Zowel ATM als ATR zijn zeer pleiotropische kinasen die veel proteïnen fosforyleren die betrokken zijn bij DNA-reparatie, celdood en overleving 4 . Beide kinasen zijn aangetoond dat het tumor-suppressor eiwit p53 fosforyleren en activeren na de blootstelling aan genotoxische stress, wat aangeeft dat deze kinasen stroomopwaartse mediators zijn van een zwenkende tumor onderdrukkende signaalas"Xref"> 5 , 6 .
De vorming en samenstelling van IRIF's wordt typisch beoordeeld door co-lokalisatie van verschillende eiwitten te bepalen met behulp van dubbelkleurige immunofluorescentie-kleuring en microscopie. Niet alle eiwitten die deel uitmaken van reparatie-eiwitcomplexen vormen IRIF's, die de toepasbaarheid van deze aanpak beperken. Bovendien wordt (confocale) immunofluorescentiemicroscopie beperkt door de diffractie-eigenschappen van licht, wat resulteert in een vrij slechte ruimtelijke resolutie van ongeveer 200-300 nm, die de grootte van de meeste subcellulaire structuren overschrijdt, die in wezen de directe ondervraging van eiwit-eiwitinteracties op Het moleculaire niveau Als zodanig is de co-lokalisatie van immunofluorescentiefleuringpatronen zoals gedetecteerd door (confocale) fluorescentiemicroscopie niet noodzakelijk indicatief voor directe eiwit-eiwitinteracties. Onlangs zijn nieuwe superresolutie technologieën ontwikkeld, zoals driedimensionale strucTured illumination microscopy (3D-SIM) 7 , die succesvol werd gebruikt om 53BP1- en BRCA1 IRIF-vorming op nano-schaaldetails te bestuderen, waarbij de ruimtelijke verdelingseigenschappen van deze eiwitten werden onthuld die niet door confocale laserscanningsmicroscopie 8 gedetecteerd werden.
Verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in vivo te detecteren, zoals co-immunoprecipitatie, aftrekmethoden en gist-tweehybride screeningsbenaderingen. Echter, deze technieken zijn nogal omslachtig, vereisen grote hoeveelheden cellen of eiwitten of betrekken overexpressie van eiwitten, die experimentele artefacten introducereert. Meer recent is een nieuwe techniek ontwikkeld die de visualisatie en kwantificering van eiwit-eiwitinteracties in situ mogelijk maakt ( dat wil zeggen in cellen en in weefsels), die wordt aangeduid als Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImary antilichamen die twee eiwitten van belang herkennen worden gedetecteerd door secundaire antilichamen die zijn geconjugeerd aan oligonucleotiden (zogenaamde PLA probes). Als de twee verschillende secundaire antilichamen dicht genoeg zijn door de interacties tussen de eiwitten die door de primaire antilichamen worden herkend, hybridiseren de geconjugeerde oligonucleotiden en kunnen zij gelaten worden om een gesloten circulaire DNA-substraat te vormen. Dit cirkelvormige substraat wordt vervolgens geamplificeerd door rollende cirkel amplificatie, en geconfigureerd met fluorochroom-geconjugeerde complementaire oligonucleotiden. Met behulp van PLA wordt de subcellulaire lokalisatie van de eiwit-eiwit-interactie bewaard, aangezien het fluorescently gemerkte rollende cirkel amplificatieproduct aan de PLA probes gehecht blijft. De resolutie van deze analyse is <50 nm, gebaseerd op de bevinding dat de diameter van een antilichaam ongeveer 7-10 nm is. Rolcirkel amplificatie kan alleen plaatsvinden in geval twee paren antilichamen (primaire + seconDary) fysiek interactie binnen de omtrek die door hun grootte wordt gedefinieerd (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). De signaalversterkingstap verhoogt de gevoeligheid van de PLA-analyse en maakt het detecteren van interacties van nauwelijks uitgedrukte proteïnen mogelijk. PLA genereert punctate, foci-achtige signalen die kunnen worden gekwantificeerd op per celbasis, waardoor de intra- en intercellulaire variatie in eiwit-eiwitinteracties kan worden beoordeeld.
De vorming en samenstelling van DNA-reparatiecomplexen en IRIF's wordt meestal bestudeerd in aanhechtende cellijnen, zoals de menselijke bot osteosarcoma epitheliale cellijn U2OS, de menselijke embryonale niercel lijn HEK293 en de retinale pigment epitheliale cellijn RPE-1, die snel- Groeiend en makkelijk te transfecteren. Suspensiecelculturen zoals een lymfoïde en myeloïde cellijnen worden minder vaak gebruikt, aangezien deze minder vatbaar zijn voor transfectie en in het algemeen niet aan de deklijsten hechten, waardoor aanvullende / alternatieve stEps voor beeldvorming. De resolutie van DNA-schade is echter zeer relevant in het kader van lymfoïde en myeloïde maligniteiten, aangezien het DNA-schaderespons vaak wordt beïnvloed door genomische (bestuurder) aberraties in deze tumoren, een cruciale rol spelen bij de kwaadaardige transformatie van normale lymfoïde en myeloïde Stamvader) cellen 12 , 13 , 14 .
Dit protocol beschrijft hoe PLA kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te beoordelen en te kwantificeren na de inductie van DNA-schade in suspensiecellenculturen. Hier wordt PLA uitgevoerd om de interacties tussen ATM en p53 te bepalen en te visualiseren bij DNA-schade in humane B-cel leukemacellen die geïnduceerd zijn om een G1-fase celcyclus arrestatie te ondergaan. Opgelet, het hier gepresenteerde protocol is niet beperkt tot het bestuderen van ATM- en p53-interacties in G1-gearresteerde leukemacellen, maar kan ook gebruikt worden om andere eiwit-eiwit interac te visualiserenIn verschillende celsoorten en suspensiecelculturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit rapport wordt aangetoond dat PLA kan worden gebruikt om de specifieke interactie tussen eiwitten in suspensiecelculturen te bepalen en te visualiseren. Opmerking, het hier beschreven protocol is niet beperkt tot de studie van DNA-reparatiecomplexen, maar is ook van toepassing op het visualiseren en kwantificeren van andere eiwit-eiwitinteracties in suspensiecelculturen. Er wordt aangetoond dat de ATM-kinase interfereert met gefosforyleerd p53 in G1-gearresteerde BCR-ABL + B-ALL-cellen wanneer blootgesteld aan een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het laboratorium van Guikema wordt gefinancierd door het Innovatieve Onderzoeksincentiveschema van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (VIDI-subsidie 016126355) en de 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (project 252).
Materials
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin’s lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
